趙 潔，曹祥莉，鐘曉波

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科/口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 401147）

運(yùn)用常規(guī)根管治療方法后仍遷延不愈的慢性根尖周炎（難治性根尖周炎）或根管治療后病變未愈合或出現(xiàn)新的根尖周病變（根管治療后疾?。┦茄荔w牙髓科醫(yī)生倍感棘手的難題。研究發(fā)現(xiàn)，約35%的根管治療后出現(xiàn)根管治療后疾病，有根管治療后疾病的患牙再次根管治療的成功率為40%～85%。其主要因?yàn)閬碓从诟腥靖艿募?xì)菌形成了根尖生物膜［1］，因此，防止細(xì)菌穿出根尖孔形成細(xì)菌滲漏是預(yù)防根尖生物膜的主要途徑之一，從而減少根管治療后疾病的發(fā)生。有學(xué)者認(rèn)為，感染根管內(nèi)的細(xì)菌以生物膜的形式存在，在未接受治療時(shí)，細(xì)菌不易穿出根尖孔，根管治療打破了根管內(nèi)生物膜的平衡，擴(kuò)增的浮游細(xì)菌增加了細(xì)菌穿出根尖孔的機(jī)會(huì)，或治療本身直接推出根尖孔的細(xì)菌，在躲避了機(jī)體免疫機(jī)制后形成了根尖生物膜，從而形成難治性根尖周炎和根管治療后疾病［2－3］。本課題小組的前期研究顯示，對(duì)于暴露在空氣中所形成的感染根管，根管下段以下的預(yù)備對(duì)細(xì)菌滲漏的形成有促進(jìn)作用。本文進(jìn)一步研究根管預(yù)備對(duì)難治性根尖周炎的優(yōu)勢細(xì)菌［4－5］——糞腸球菌形成細(xì)菌滲漏的影響，為臨床預(yù)防根尖生物膜的形成提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 PCR儀（德國Eppendorf公司），電泳儀（北京市六一儀器廠），凝膠成像儀（美國Bio－Rad公司），K銼、流動(dòng)樹脂（美國DENTSPLY公司），細(xì)菌DNA提取試劑盒（Tiangen公司），2×Master Mix（大連 Takara公司），引物（上海生物工程公司），糞腸球菌（ATCC 29212）。

1.2 方法

1.2.1 離體牙納入標(biāo)準(zhǔn) 選取患者因正畸減數(shù)拔除的單根前磨牙，年齡14～25歲，根尖孔發(fā)育完全，無齲壞、根尖周炎及牙周疾病，無根裂、根折或牙根吸收等明顯的牙體組織缺陷。用刮匙去除牙根表面軟組織和牙石，利用游標(biāo)卡尺測量牙體長度：頰尖頂端至解剖根尖孔長度的基礎(chǔ)上減去1mm。在100 mL/L甲醛溶液中室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 糞腸球菌感染根管－根尖周組織復(fù)合體體外模型的建立 按照王容等［6］所建立的方法制作模型20個(gè)，抽取10個(gè)作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行開髓后接種糞腸球菌，于建模后21d通過16SrRNA通用引物PCR法及糞腸球菌特異16SrRNA引物檢測根尖周組織及根管內(nèi)細(xì)菌。若對(duì)照組根尖周檢測到細(xì)菌則說明模型制備不成功，重新制作模型；若對(duì)照組根尖周未檢測到細(xì)菌，而實(shí)驗(yàn)組根管內(nèi)也只檢測到糞腸球菌則說明建模成功。

1.2.3 根管預(yù)備對(duì)糞腸球菌感染根管－根尖周生物膜形成的影響 同樣方法建立模型310個(gè)，分為對(duì)照組（A組n＝70）、實(shí)驗(yàn)組（n＝240）。實(shí)驗(yàn)組做開髓處理后接種糞腸球菌，對(duì)照組不做任何處理。全部置于三氣培養(yǎng)箱（含5%O2，85%N2，10%CO2；溫度37℃）中，于21d隨機(jī)抽取10個(gè)對(duì)照組模型通過16SrRNA通用引物PCR法檢測根尖周組織細(xì)菌，確定建模成功后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組通過相應(yīng)干擾進(jìn)行分組，髓腔干擾組即B組（n＝60）、根管上2/3受干擾組即C組（n＝60）、全長受干擾組即D組（n＝60）及超長干擾組即E組（n＝60）。之后放入三氣培養(yǎng)箱（含5%O2，85%N2，10%CO2；溫度37℃）中。5組分別于干擾后1、7、21、35、49、63d進(jìn)行PCR檢測（期間每2天用滅菌針管通過開髓孔滴入新鮮滅菌液態(tài)BHI培養(yǎng)基）。根據(jù)結(jié)果利用SEM進(jìn)行Ef根尖生物膜觀察并對(duì)根尖周細(xì)菌進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

表1 用于本研究的預(yù)期PCR引物，擴(kuò)增子的大小和熱循環(huán)參數(shù)

1.2.4 樣本采集及檢測 樣本采集：在超凈工作臺(tái)中，取下固定有離體牙的青霉素瓶塞，之后收集根尖周BHI固態(tài)培養(yǎng)基于裝有1mL雙蒸水的1.5mL滅菌離心管中，震蕩30s后吸取100μL洗脫液作細(xì)菌培養(yǎng)，其余洗脫液置－20℃冰箱保存待檢。樣本檢測：樣本室溫下解凍后，提取DNA，嚴(yán)格按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書提取樣本中細(xì)菌DNA。電泳：PCR擴(kuò)增體系見表1，擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠檢測。

細(xì)菌培養(yǎng)方法：在超凈工作臺(tái)中，利用滅菌接種環(huán)沾取樣本根尖周區(qū)域可見白色菌膜的瓊脂培養(yǎng)基，之后用三段分區(qū)劃線法將細(xì)菌接種于預(yù)先滅菌的BHI瓊脂培養(yǎng)皿中，注意每一段均需滅菌接種環(huán)。之后放置培養(yǎng)皿于三氣培養(yǎng)箱（含5%O2，85%N2，10%CO2；溫度37℃）中。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌檢測 將提取出的根尖周細(xì)菌總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠檢測。建模后接種糞腸球菌，21d時(shí) A、B、C、D、E 5組根尖區(qū)樣本均未擴(kuò)增出16SrDNA通用引物片段，見圖1a。根管預(yù)備干擾后1d，E組根尖區(qū)樣本擴(kuò)增出糞腸球菌16SrDNA特異性引物片段，其余各組均未檢測到，見圖1b。根管預(yù)備干擾后7d，D組根尖區(qū)樣本亦擴(kuò)增出糞腸球菌16SrDNA特異性引物片段，A組、B組及C組仍未檢測到，見圖1c。根管預(yù)備干擾后21、35、49、63 d，A、B、C組均未檢測到，見圖1d。圖1中陽性對(duì)照組、雙蒸水空白對(duì)照組為PCR特有的對(duì)照組。

2.2 根尖周生物膜電鏡掃描結(jié)果 對(duì)根尖區(qū)擴(kuò)增出糞腸球菌16SrDNA特異性引物片段的樣本進(jìn)行掃描電鏡觀察。結(jié)果顯示，D組中根尖區(qū)糞腸球菌呈團(tuán)狀附著于根壁，菌體被無定性基質(zhì)包裹形成生物膜結(jié)構(gòu)。A組則明顯無任何細(xì)菌附著。見圖2。

圖1 根尖區(qū)樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 根尖區(qū)樣本電鏡掃描圖片

2.3 細(xì)菌培養(yǎng) 對(duì)檢測到細(xì)菌的D、E組進(jìn)行根尖周細(xì)菌培 養(yǎng)，兩組各10個(gè)樣本，結(jié)果顯示，均為糞腸球菌活菌且無雜菌，見圖3。

圖3 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

3 討 論

研究顯示，難治性根尖周炎及根管治療后疾病的原因主要是根尖生物膜的形成［7－8］。而對(duì)于牙周健康的患牙，根尖生物膜的細(xì)菌則來源于感染根管［9－10］。有學(xué)者通過研究拔除的患牙發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的慢性根尖周炎患牙，在根尖周不易檢出根尖生物膜的存在，而經(jīng)過治療的患牙，反而容易檢出根尖生物膜［11－12］，提示根管治療本身，因打破了根管內(nèi)細(xì)菌生物膜的平衡，增加了細(xì)菌穿出根尖孔導(dǎo)致細(xì)菌滲漏的可能。

本實(shí)驗(yàn)將糞腸球菌接種于體外模型中的離體牙根管中，待形成感染根管（21d）后對(duì)其進(jìn)行根管預(yù)備干擾［13］。同時(shí)應(yīng)用PCR具有特異性及敏感性的糞腸球菌引物檢測其16SrDNA來鑒別，快速，靈敏度高［14］。但因PCR并不能說明細(xì)菌的活性，因此在實(shí)驗(yàn)最后進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，從而驗(yàn)證根尖周糞腸球菌生物膜為活菌，進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)的可行性及準(zhǔn)確性。

在根管預(yù)備前檢測A、B、C、D、E組根尖周均未檢測糞腸球菌；預(yù)備后1d時(shí)，E組根尖周即檢測到糞腸球菌；7d時(shí)，D組檢測到糞腸球菌，而A、B、C組根尖周在所有檢查時(shí)間點(diǎn)均未檢測到糞腸球菌。推測原因，超長預(yù)備，器械穿出了根尖孔，可將細(xì)菌直接推出根尖孔；全長預(yù)備，臨近根尖孔的生物膜受到干擾，增加的浮游細(xì)菌容易穿出根尖孔；而根管上2/3預(yù)備，增加的游離細(xì)菌距離根尖孔有距離，不易穿出根尖孔，因而在根尖周未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌。

對(duì)于機(jī)體，有免疫機(jī)制的存在，即使細(xì)菌穿出了根尖孔，并不意味著它就能存活、生長繁殖并形成生物膜［15］。機(jī)體免疫機(jī)制對(duì)細(xì)菌滲漏的影響，是今后進(jìn)一步研究的課題。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在不考慮免疫機(jī)制的情況下，超出根尖孔的預(yù)備和根管下段的預(yù)備對(duì)細(xì)菌滲漏甚至細(xì)菌生物膜的形成有促進(jìn)作用，為根管治療后疾病及難治性根尖周炎埋下隱患。因此對(duì)于可能存在免疫缺陷者感染根管，在實(shí)際臨床操作中，可先行根管上2/3預(yù)備并封藥消毒，以減少細(xì)菌量及其活性。再行根管全長預(yù)備并避免器械超出根尖孔?；蚩梢欢ǔ潭壬项A(yù)防細(xì)菌穿出根尖孔造成細(xì)菌滲漏，從而減少難治性根尖周炎及根管治療后疾病的發(fā)生。

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