尤 楊， 馮 倩， 夏 岳， 戚國慶， 楊志瑜

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)三科， 河北 石家莊 050031 2.河北省張家口市第一醫(yī)院心內(nèi)三科， 河北 張家口 075000)

匹伐他汀對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用*

尤 楊1， 馮 倩2， 夏 岳1， 戚國慶1， 楊志瑜1

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)三科， 河北 石家莊 050031 2.河北省張家口市第一醫(yī)院心內(nèi)三科， 河北 張家口 075000)

目的:探討匹伐他汀對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，為他汀類藥物在缺血再灌注心肌的臨床應(yīng)用上提供理論依據(jù)。方法:成年雄性SD大鼠42只隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、對照組(IR組)及實(shí)驗(yàn)組(Statin組)，每組14只。Sham組與IR組術(shù)前給予生理鹽水2mL/d灌胃4周，Statin組給予匹伐他汀0.42mg·kg－1·d－1，溶解成2mL灌胃4周。制作大鼠心肌缺血－再灌注模型時(shí)假手術(shù)組冠狀動(dòng)脈下只穿線，不結(jié)扎，無缺血－再灌注發(fā)生。IR組、Statin組均結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)30min，再松解120min。術(shù)后檢測血清中肌酸激酶同工酶(CK－MB)水平，用氯化三苯基四氮唑(TTC)及伊文氏藍(lán)(Evans blue)雙染色法測定各實(shí)驗(yàn)組心肌梗死面積及缺血區(qū)面積。結(jié)果:與Sham組相比，IR組、Statin組的血清CK－MB水平顯著升高(P＜0.01);Statin組CK－MB升高水平低于IR組(P＜0.05)。I/R組、Statin組缺血區(qū)面積差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與I/R組相比，Statin組梗死面積顯著減小(P＜0.05)。結(jié)論:匹伐他汀可以減少缺血再灌注后心肌梗死面積，從而減輕心肌缺血再灌注損傷。

心肌缺血再灌注損傷; 匹伐他汀; CK－MB; 心肌梗死面積

目前再灌注治療已廣泛應(yīng)用于各種急慢性心肌缺血人群，尤其是對于急性心肌梗死患者，盡早開通梗死相關(guān)動(dòng)脈，迅速恢復(fù)梗死相關(guān)動(dòng)脈的前向血流，可以挽救瀕臨死亡的心肌、限制梗塞面積、保護(hù)心肌泵功能、改善預(yù)后。然而近年來研究發(fā)現(xiàn)再灌注治療可使缺血心肌在一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血液再灌注，但原心功能不僅沒有恢復(fù)，反而出現(xiàn)了功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重的現(xiàn)象，即心肌缺血再灌注損傷(MIRI)［1］。他汀類藥物是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的調(diào)脂藥物，且在防治心肌缺血再灌注損傷的研究中，他汀類藥物顯示出不同時(shí)段、不同機(jī)制的心臟保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)選用第三代他汀藥物“匹伐他汀”，制作匹伐他汀預(yù)處理的大鼠心肌缺血－再灌注模型，觀察匹伐他汀預(yù)處理對大鼠心肌梗死面積的影響，并進(jìn)一步探討其對心肌缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制，為他汀類藥物在干預(yù)缺血再灌注心肌的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:實(shí)驗(yàn)用成年雄性清潔級(jí)SD大鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):醫(yī)動(dòng)字第04038，動(dòng)物等級(jí):無特定病原體動(dòng)物。主要試劑:肌酸激酶同工酶(CK－MB)檢測試劑(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科);伊文思藍(lán)(Evans blue美國Sigma公司);氯化三苯基四氮唑(TTC美國 Sigma公司); 10%水合氯醛(河北醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室);10%福爾馬林溶液(河北醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室);匹伐他汀片劑:(2mg/片，日本興和株式會(huì)社)。主要儀器:ECG－9620P三道自動(dòng)分析心電圖機(jī)(上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司);HX－3實(shí)驗(yàn)用人工呼吸機(jī)(正達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)公司);手術(shù)器械、7/0 Prolene線(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院手術(shù)室);電子天平(德國Sartorius AG公司);SBHW－IV電熱恒溫水浴箱(北京市醫(yī)療設(shè)備廠);LDZ5－2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);－20℃冰箱(青島伊萊克斯有限公司);UNICEL DXC800全自動(dòng)生化分析儀(德國BECKMAN COULTER公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制作:參考文獻(xiàn)［2，3］的方法:經(jīng)10%水合氯醛以3mL/kg腹腔注射麻醉，氣管插管，接人工呼吸機(jī)。實(shí)驗(yàn)大鼠四肢皮下均插入針式電極，將電極尾端連接于心電圖相應(yīng)的肢體導(dǎo)聯(lián)線上，選取Ⅱ?qū)?lián)作為記錄導(dǎo)聯(lián)，記錄正常心電圖(紙速 100mm/s，電壓20mm/mV)對照。開胸，暴露左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間的心大靜脈，并以此血管為標(biāo)志，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)。先在結(jié)扎線下放一根lmm的乳膠管，結(jié)扎過程中嚴(yán)密監(jiān)測心肌顏色改變，如心肌顏色變深，則結(jié)扎松緊度相對適宜。將LAD結(jié)扎30min，然后松線120min。模型制作成功標(biāo)準(zhǔn):結(jié)扎LAD后左室前壁局部心肌立刻由鮮紅立即變深、紫紺，心電圖顯示ST段弓背向上抬高≥0.2mV，T波電壓增高，或QRS波幅升高及時(shí)限增寬;松開結(jié)扎線恢復(fù)冠脈血流，缺血部位心肌顏色恢復(fù)，T波迅速回落、ST段驟降50%以上提示冠狀動(dòng)脈成功再通。

1.2.2 動(dòng)物分組:SD大鼠共42只，隨機(jī)分為3組，術(shù)前3個(gè)組均于每日上午8:30～9:30，25℃室溫下以生理鹽水等量等溫灌胃，每日1次。假手術(shù)組(Sham組，n=14):生理鹽水2mL/d灌胃4周，術(shù)中LAD下只穿線，不結(jié)扎，無再灌注。缺血再灌注組(I/R組，n= 14):生理鹽水2mL/d灌胃4周，術(shù)中結(jié)扎 LAD 30 min，再松解120 min。匹伐他汀組(Statin組，n=14):術(shù)前匹伐他汀0.42mg·kg－1·d－1用生理鹽水溶解成2mL，每日1次，灌胃4周。

1.3 觀測指標(biāo):①心電圖;②CK－MB:各組隨機(jī)抽取8只大鼠于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)間點(diǎn)開腹，取靜脈血1mL加入促凝管，室溫靜置離心后取上層血清，－20℃冰箱中保存，用UNICEL DXC800全自動(dòng)生化分析儀測定CKMB含量;③心肌梗死面積:各組余6只大鼠，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)間點(diǎn)原位結(jié)扎LAD，將1mL 5%Evans blue溶液注入左室內(nèi)以標(biāo)記缺血區(qū)(無藍(lán)色)和非缺血區(qū)(藍(lán)色)，待大鼠口唇青紫時(shí)迅速取左心室，取心尖端3mm厚心肌(垂直心室長軸方向)，其余心肌組織置于－20℃冰箱30min，自心尖向心底部取2mm厚切片5片(垂直心室長軸方向)，置于1%TTC溶液中，在37℃恒溫水浴箱中避光孵浴10～15min以標(biāo)記缺血區(qū)及梗死區(qū)，再以10%福爾馬林溶液固定24h以增強(qiáng)染色顏色對比。選取朝向心尖部的切面為面積分析切面:藍(lán)色為正常心肌，粉色為缺血心肌，灰白色為梗死心肌。用計(jì)算機(jī)分析軟件測定梗死區(qū)面積(AN):梗死面積為心臟總梗死區(qū)面積占總危險(xiǎn)區(qū)面積(AAR，即缺血區(qū)與梗死區(qū)面積之和)的百分比(AN/AAR)，危險(xiǎn)區(qū)面積為危險(xiǎn)區(qū)面積占左室面積(LV)的百分比(AAR/LV)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以正態(tài)性齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn);非正態(tài)分布的計(jì)數(shù)資料用中位數(shù)表示，比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心電圖變化:結(jié)扎LAD前大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖顯示心律齊，無ST－T及QRS波的改變;成功結(jié)扎LAD后，心電圖出現(xiàn)ST段弓背向上抬高≥0.2mV，伴或不伴T波高尖，新發(fā)病理性Q波或原q波加深，QRS波群增寬;再灌注后出現(xiàn)T波迅速回落、ST段下降≥50%，再灌注時(shí)記錄有房室傳導(dǎo)阻滯、室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)等再灌注心律失常發(fā)生。

2.2 血清CK－MB水平比較:與假手術(shù)組比較，IR組、Statin組的血清CK－MB水平升高顯著(P＜0.01)，Statin組CK－MB升高水平低于IR組(P＜0.05)。見表1。

2.3 心肌梗死面積的比較:IR組、Statin組AAR/LV差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與IR組相比，Statin組梗死面積顯著減少(P＜0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見表2)。

表1 血清CK－MB水平比較(±s，n=8)

表1 血清CK－MB水平比較(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.01;與IR組比較，#P＜0.05

假手術(shù)組(IU/L)缺血再灌注組(IU/L)匹伐他汀組(IU/L) CK－MB 19.88±3.60 84.25±9.25* 76.88±5.82*#

表2 心肌梗死面積的比較(±s)

表2 心肌梗死面積的比較(±s)

注:與I/R組比較，*P＞0.05，#P＜0.01

部位 組別缺血再灌注組 匹伐他汀組P AAR/LV(%) 37.31±5.05 36.49±3.65* 0.754*AN/AAR(%) 65.44±7.61 48.57±9.14# 0.006#

3 討 論

目前臨床上心肌缺血再灌注治療可使缺血相關(guān)冠狀動(dòng)脈盡早、最大程度地持久開通，恢復(fù)有效的冠狀動(dòng)脈前向血流，縮小心肌梗死面積，抑制心室重構(gòu)，保護(hù)心肌功能，提高此類患者的存活率，改善預(yù)后。但目前臨床工作中?？捎^察到再灌注治療后反而出現(xiàn)了心律失常、心肌頓抑、心肌細(xì)胞壞死以及與內(nèi)皮細(xì)胞及微血管功能障礙相關(guān)的“無復(fù)流”現(xiàn)象。CK－MB是一種存在于心肌細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶，當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)，這種蛋白酶便可通過受損的細(xì)胞釋放到血液中，故外周血血清中CK－MB水平變化可以作為反映心肌細(xì)胞壞死程度的較敏感指標(biāo)。他汀類藥物是目前臨床上常用的調(diào)脂藥物，目前多項(xiàng)臨床試驗(yàn)均已證實(shí)長期應(yīng)用他汀類藥物可減少冠脈事件的發(fā)生，尤其是急性心肌梗死早期缺血相關(guān)事件的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:經(jīng)過匹伐他汀預(yù)處理后的大鼠與單純?nèi)毖俟嘧⒔M大鼠比較，血清CK－MB升高程度顯著降低，而心肌梗死面積也顯著減小，說明匹伐他汀預(yù)處理可以明顯減輕缺血再灌注心肌損傷。近年來，國內(nèi)外多項(xiàng)他汀類藥物相關(guān)研究發(fā)現(xiàn):大鼠心肌缺血前給予相應(yīng)的預(yù)處理方案，經(jīng)歷了再灌注后其心肌梗死面積顯著減少，且減少幅度可能與他汀類藥物的使用存在劑量依賴性。

因?yàn)槟壳八☆愃幬飳π募∪毖俟嘧p傷的保護(hù)作用機(jī)制尚不明確，推測可能與他汀類藥物的多途徑心臟保護(hù)作用有關(guān)。大量臨床試驗(yàn)研究證明，他汀類藥物的降膽固醇作用，可顯著降低冠心病一級(jí)和二級(jí)預(yù)防中各類冠狀動(dòng)脈事件的發(fā)生率，也可在二級(jí)預(yù)防中降低全因死亡率［4］。另外，他汀類藥物還存在強(qiáng)大的獨(dú)立于調(diào)脂作用之外的其它保護(hù)作用，即他汀類藥物的多效性。他汀的非降脂作用包括:改善血管內(nèi)皮功能［5］、抗炎［6］、抗氧化應(yīng)激［7］、抗血小板聚集和抑制血栓形成［8］、抑制心臟電生理重構(gòu)、調(diào)節(jié)心臟植物神經(jīng)功能［9］等。最近研究還發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以明顯減輕MIRI［10～12］。他汀類抗心肌缺血再灌注損傷是通過NO實(shí)現(xiàn)的［13，14］。Tavackoli等［15］選用辛伐他汀給大鼠進(jìn)行預(yù)處理3d后制作I/R模型，結(jié)果顯示辛伐他汀預(yù)處理組心肌梗死范圍較單純I/R組顯著減小。短期阿托伐他汀治療能明顯減少I/R心肌梗死面積，降低血清CK、LDH水平，減輕大鼠心肌I/R損傷，使經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PTCA)后患者血中可溶性細(xì)胞黏附因子－1水平降低，對防止PTCA后細(xì)胞黏附、血管再閉塞起一定作用。他汀類藥物還可以破壞氧化應(yīng)激，降低還原型輔酶活性、抑制核因子(NF)－κB、活性氧、髓過氧化物酶、白細(xì)胞的粘附和活性及炎癥介質(zhì)的表達(dá)，上調(diào)抗氧化酶活性，從而降低炎癥反應(yīng);另外，此類藥物可抑制人體內(nèi)皮細(xì)胞RhoA蛋白的活性、抑制RhoA蛋白向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)錄，增加NO的產(chǎn)生和釋放，抑制動(dòng)脈粥樣硬化和內(nèi)膜增生進(jìn)程，發(fā)揮其對心肌及血管的保護(hù)作用。

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The Positive Role of Pitavastatin in Prevention of Ischemia－reperfusion Myocardial Injury

YOU Yang， et al
(The First Hospital of Hebei Medical University，Hebei Shijiazhuang050031，China)

Objective:To explore the positive role of pitavastain in a rat model of myocardial ischemiareperfusion，provide a theoretical basis for pitavastain clinical application in myocardial ischemia－reperfusion.Method:A total of 42 male SD rats were randomly assigned to three groups:Sham group，control group(IR group)and experimental group(Statin group).In Sham group and control group，2mL saline were irrigated into stomach daily for 4 weeks，0.42mg/kg pitavastain dissolved in 2mL saline were given in experimental group.In surgery，we weared line under the coronary artery without ligation in Sham group，and ligated the line for 30 minutes and then released it for 120 minutes in IR group and Statin group.The levels of CK－MB were discerned after operation.Triphenyl tetrazolium chloride and Evans blue double staining method was used to determinat the myocardial infarct size and ischemic area in each experimental group.Result:The levels of CK－MB in control group and experimental group elevated significantly compared with Sham group(P＜0.01).The level of CK－MB in IR group was significantly higher than Statin group(P＜0.05).There was no significant difference in I/R and Statin group compared with ischemic area(P＞0.05).But when it comes to infarct size，it was more smaller in Statin group(P＜0.05).Conclusion:Pitavastatin couldreduce the cardiac infarct area and alleviate myocardial ischemia－reperfusion injury.

Myocardial ischemia－reperfusion injury; Pitavastatin; CK－MB; Cardiac infarct area

A

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.05.002

1006－6233(2015)05－0709－04

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃，(編號(hào):112761155)