高粱遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

張 微，王良群，劉 勇，郝艷芳，楊 偉，白鴻雁，武 擘

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，山西晉中 030600)

摘要介紹了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電激法、花粉管通道法4種高粱遺傳轉(zhuǎn)化方法，并提出了今后高粱遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)集中研究的問題。

關(guān)鍵詞遺傳轉(zhuǎn)化；高粱；研究進(jìn)展

中圖分類號S514；Q813.1

基金項(xiàng)目山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所所級科研項(xiàng)目(2014-1-1)。

作者簡介張微(1983- )，女，山西太原人，助理研究員，碩士，從事高粱新技術(shù)育種及高粱轉(zhuǎn)基因研究。

收稿日期2015-08-14

Advances in the Genetic Transformation ofSorghumbicolor

ZHANG Wei, WANG Liang-qun, LIU Yong et al(Sorghum Research Institute of Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Jinzhong, Shanxi 030600)

AbstractFour methods of the genetic transformation of sorghum were introduced, including Agrobacterium mediated transformation, particle bombardment, electroporation, pollen-tube pathway, some suggestions for research into the genetic transformation of Sorghum were put forward.

Key wordsGenetic transformation;Sorghum; Research progress

高粱是全世界僅次于小麥、水稻、玉米、大豆和馬鈴薯等的重要作物之一，是糧食、飼料和釀酒業(yè)原料的重要來源，尤其是對于亞洲和非洲的發(fā)展中國家[1-2]。其作為一種C4植物，光合效率非常高，生長期較短(約4個(gè)月)，水分需求量低，對鹽堿和干旱都有較強(qiáng)的抵抗力和適應(yīng)能力[3-4]。但由于高粱的種質(zhì)資源缺乏和有性雜交不親和等原因，采用傳統(tǒng)育種方法限制了它的遺傳改良，采用基因工程可以將新基因?qū)敫吡唬瑸槠溥z傳改良提供了新的途徑[5-7]。但植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)一般依賴于植物高頻率再生體系的建立。盡管高粱很早就開始了遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究，但被公認(rèn)為是遺傳轉(zhuǎn)化最困難的作物之一，與其他具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的和本科作物如水稻、小麥和玉米相比，其遺傳轉(zhuǎn)化的研究工作進(jìn)展相對緩慢[8-9]，但已取得一些成果。筆者總結(jié)了近年來有關(guān)高粱遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展，詳細(xì)介紹了遺傳轉(zhuǎn)化的概念、幾種已在高粱上成功應(yīng)用的遺傳轉(zhuǎn)化方法，并展望了今后研究中的問題，以期為高粱，尤其是甜高粱的遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。

1高粱遺傳轉(zhuǎn)化的概念

高粱的遺傳轉(zhuǎn)化是指將外源基因轉(zhuǎn)移到高粱體內(nèi)并穩(wěn)定的整合表達(dá)與遺傳的過程。在該過程中，建立高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的先決條件。不同品種，甚至是同一品種不同基因型其轉(zhuǎn)化體系也有很大的差異。在高粱遺傳轉(zhuǎn)化研究中，用于外源基因?qū)氲姆椒ㄓ修r(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電激法、花粉介導(dǎo)的超聲波轉(zhuǎn)化法等，每種方法都有其各自的特點(diǎn)[10]。上述方法已在高粱上應(yīng)用，并取得進(jìn)展。

2高粱遺傳轉(zhuǎn)化的方法

2.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是利用農(nóng)桿菌的天然侵染過程，實(shí)現(xiàn)外源基因轉(zhuǎn)移和整合的方法。用于遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌一般是廣泛寄生于雙子葉植物和裸子植物的土壤桿菌屬(Agrobacterium)細(xì)菌。它是人們在兩類土壤細(xì)菌——根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefacines)和發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)中發(fā)現(xiàn)的。一般情況下，農(nóng)桿菌不侵染單子葉植物，但近來有研究表明，對單子葉植物也有侵染力。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首先在玉米和水稻中獲得了成功。隨后有學(xué)者利用農(nóng)桿菌在高粱的遺傳轉(zhuǎn)化中侵染高粱的分生組織獲得了成功[11]。Zhao等[12]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，首次用高粱的幼胚作為受體材料，將外源基因uidA基因和bar基因?qū)敫吡唬晒Φ孬@得了轉(zhuǎn)基因植株。Seetharama等[13]發(fā)現(xiàn)水稻中的chitinasG11和tlp2個(gè)PR基因?qū)︾牭睹骨o腐病有抗性，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該2個(gè)基因轉(zhuǎn)到高粱自交系中，得到的后代對鐮刀霉莖腐病有中度抗性。在國內(nèi)也有學(xué)者利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行高粱遺傳轉(zhuǎn)化成功的報(bào)道。張明洲等[14]利用高粱幼穗的愈傷組織作為受體材料，通過含有g(shù)us基因和抗潮霉素的雙元載體將殺蟲晶體蛋白基因cry1Ab導(dǎo)入高粱品種5-27、ICS21B和115中，最終獲得了21個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為1.90%。朱莉等[15]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法用甜高粱幼穗愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，將密碼子優(yōu)化過的Btcry1Ah導(dǎo)入MN-3025和BABUSH 2個(gè)甜高粱品種中，最終獲得了66 株再生植株，經(jīng)PCR鑒定其中有22株為陽性植株，轉(zhuǎn)化率為2.38%。朱莉等[9]還發(fā)現(xiàn)Btcry1Ah基因?qū)τ衩酌锌剐?，將其?dǎo)入高粱品種中，表現(xiàn)出一定的抗性。肖軍等[16]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將殺蟲晶體蛋白基因cryAb基因?qū)敫吡恢?，成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株。張明洲等[14]發(fā)現(xiàn)cry1Ab基因有殺蟲的作用，利用高梁幼穗愈傷組織將其導(dǎo)入3個(gè)品種中，得到抗大螟(Sesamiainferens)的轉(zhuǎn)基因高梁植株。

總的來說，該方法十分簡單，而且效果良好，為植物利用外植體作為材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化提供了一種新的方法。許多研究學(xué)者相繼在不同的植物上獲得了許多轉(zhuǎn)基因植株，其中80%都是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的，截止目前已經(jīng)超過200種。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已成為植物遺傳轉(zhuǎn)化中最主要和最普遍的方法。但該方法的成功取決于受體材料、農(nóng)桿菌菌株、培養(yǎng)基、vir區(qū)基因等多種因素。

2.1.1受體材料的選擇。受體材料的選擇是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行高粱遺傳轉(zhuǎn)化體系能否成功建立的關(guān)鍵因素，研究表明其必須具有較高的遺傳穩(wěn)定性和再生能力，還要測定它對選擇抗生素和農(nóng)桿菌的高度敏感性。從成功獲得轉(zhuǎn)基因植株的實(shí)例可以看出高粱的莖尖、葉片、幼胚、成熟胚以及幼穗所誘導(dǎo)的愈傷組織都是高粱理想的受體材料，其中高粱的幼穗的高效再生能力最強(qiáng)，但其采收又受到了季節(jié)的限制，不能隨時(shí)取材。劉宣雨等[17]通過甜高粱幼穗誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行再生培養(yǎng)，成功獲得了穩(wěn)定的再生體系。Lu等[18]在研究如何提高高粱中的賴氨酸含量時(shí)，以高粱未成熟胚為對象，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，選取來自擬南芥的經(jīng)過優(yōu)化處理的tRNAlys基因和高粱的1ys1tRNA合成酶元仲基因，轉(zhuǎn)入高粱組織中，后代經(jīng)檢測為轉(zhuǎn)基因再生植株。此外，肖軍等[19]研究表明，對受體材料進(jìn)行預(yù)處理，可以提高高粱的轉(zhuǎn)化效率。

2.1.2農(nóng)桿菌菌株。根據(jù)攜帶不同Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的冠癭瘤所產(chǎn)生的冠癭瘤類型，將根癌農(nóng)桿菌分為農(nóng)桿堿型、胭脂堿型和章魚堿型3種。同理，根據(jù)攜帶不同Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的冠癭瘤所產(chǎn)生的冠癭瘤類型，將發(fā)根農(nóng)桿菌分為黃瓜堿型、甘露堿型和農(nóng)桿堿型3種。上述6種不同類型的農(nóng)桿菌所攜帶的Ti質(zhì)粒或Ri質(zhì)粒的DNA片段可以整合到植物的基因組中，該片段叫做轉(zhuǎn)移DNA。不同菌株對同一植物的轉(zhuǎn)化效率有很大的差別，是由于不同的農(nóng)桿菌菌株具有不同的宿主范圍[17]。肖軍等[19]研究表明，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)高粱遺傳轉(zhuǎn)化過程中，最適宜的菌液濃度(OD600值)為0.5～0.7，共培養(yǎng)培養(yǎng)基的最佳溫度為22～25 ℃，最佳pH是5.2～5.6，最佳共培養(yǎng)時(shí)間是3 d，乙酰丁香酮的濃度為100 μmol/L時(shí)高粱愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化達(dá)到最佳效果。

2.1.3培養(yǎng)基的選擇。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)高粱的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，共培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分要利于高粱細(xì)胞旺盛生長和持續(xù)的分裂狀態(tài)，更要有利于農(nóng)桿菌的高效轉(zhuǎn)染。有研究表明，共培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分與不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基相同[7]。Carvalho等[20]研究表明，在共培養(yǎng)中添加椰子汁，可以提高植株外植體的成活率。

2.1.4vir區(qū)基因的活化。大多數(shù)植物組織在受到創(chuàng)傷后，植物細(xì)胞便會(huì)分泌一些酚類化合物，這些酚類化合物可以誘導(dǎo)vir區(qū)基因的活化，使農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化得以實(shí)現(xiàn)?？茖W(xué)家首先從煙草的愈傷組織、根和葉中提取到羥基乙酰丁香酮(OH-AS)和乙酰丁香酮(AS)，并且證明它們能促進(jìn)vir區(qū)基因的活化。此外，研究中也發(fā)現(xiàn)植物中的其他酚類化合物如對羥苯甲酸、沒食子酸、兒茶酚和3，4-二羥苯甲酸等均可使vir區(qū)基因活化，但其中最有效的是乙酰丁香酮。肖軍等[19]研究表明，乙酰丁香酮的濃度為100 μmol/L時(shí)高粱愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化達(dá)到最佳效果。Zhao等[12]也得出研究結(jié)論，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)高粱遺傳轉(zhuǎn)化過程中，乙酰丁香酮為100 μmol/L時(shí)使高粱達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率。乙酰丁香酮一般有2種用法：一是在培養(yǎng)農(nóng)桿菌液體時(shí)加入，一般在配制侵染液前4～6 h加入。此時(shí)的農(nóng)桿菌處于對數(shù)生長期，又處于vir區(qū)基因高度活化狀態(tài)，可提高農(nóng)桿菌的侵染能力。二是加在共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。

2.2基因槍法基因槍法，又名微粒轟擊法?；驑屴D(zhuǎn)化就是通過高速飛行的金屬顆粒將包被其外的目的基因直接導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的一種方法?；驑尶煞譃?種類型：一類是以火藥爆炸力作為動(dòng)力；一類是以高壓氣體作為動(dòng)力；一類是以高壓放電作為動(dòng)力。無論哪類基因槍，其基本原理相同。即利用火藥爆炸力、高壓放電或機(jī)械加速的金屬顆粒來轟擊受體細(xì)胞。先將外源DNA溶液與鎢、金等金屬微粒共同保溫，使DNA吸附在金屬顆粒表面，然后用各種動(dòng)力加速金屬顆粒，使之直接射入受體植物細(xì)胞，外源遺傳物質(zhì)隨金屬顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，導(dǎo)致植物發(fā)生可遺傳的變異。Casas等[21]首次報(bào)道了利用基因槍法成功地將抗除草劑基因?qū)敫吡恢?，以高粱的未成熟胚作為受體材料，利用包被pat基因的鎢彈(DPuont no.75056)、bar基因、nptll基因和金彈(Adlrich no.32，658-5)進(jìn)行轟擊，結(jié)果表明在600個(gè)受轟擊的幼胚中，有2個(gè)獲得了轉(zhuǎn)基因植株，并穩(wěn)定遺傳給后代。Tadesse等[22]試圖提高高粱中的賴氨酸含量，其通過基因槍法將dhdps-r1基因?qū)氲轿闯墒炫吆颓o尖中，獲得10株植株，經(jīng)檢驗(yàn)為轉(zhuǎn)化株，但后代中的賴氨酸含量較對照沒有提高，其原因有待進(jìn)一步研究。

在高粱中利用基因槍法轉(zhuǎn)化成功的報(bào)道較多，如Kononowicz等[23]在1995年報(bào)道，用基因槍法將bar基因轉(zhuǎn)化入高粱幼穗誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織。此后有大量類似的報(bào)道。但研究發(fā)現(xiàn)利用基因槍法將bar基因?qū)敫吡缓?，受體材料雖具有雙丙氨膦抗性，但得到的體外培養(yǎng)組織很少[24]。

來自大麥的HVA1基因在植物體遇到干旱、鹽堿和極端溫度等逆境脅迫下能夠大量積累某種特異性的蛋白，與植物的抗逆能力相關(guān)。為了提高高粱抗旱能力，有學(xué)者將該基因利用基因槍法導(dǎo)入高粱栽培的莖尖中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，抗旱能力表達(dá)較弱[16]。mtlD基因能夠提高植物對水壓和鹽分的耐受能力，其機(jī)理是誘導(dǎo)甘露醇的大量合成，印度學(xué)者曾試圖將該基因?qū)敫吡?，獲得耐鹽能力高的高粱品種[25]。Zhu等[8]利用基因槍法將水稻的chitinase基因和bar基因?qū)敫吡蝗旧|(zhì)中，后代表現(xiàn)出抗菌、抗除草劑，并能夠穩(wěn)定地表達(dá)。石太淵等[26]試圖將小麥中的(HMW)谷蛋白基因1Ax1導(dǎo)入高粱中，后代子粒中的面筋含量有一定的提高。

蟲害對高粱威脅較大，每年因?yàn)橄x害造成的高粱減產(chǎn)約10億美元[27]。為了解決上述問題，Girijashankar等[28]用基因槍法將抗條螟(Chilopartellusswinhoe)的3個(gè)基因?qū)敫吡坏那o尖中，以期提高高粱抗性。結(jié)果表明，與對照相比，轉(zhuǎn)mpiC1-cry1Ac基因的后代對C.partellus初齡幼蟲有一定抗性，而其他2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的抗性很低。朱莉等[9]將對玉米螟有較高抗性的抗蟲轉(zhuǎn)基因?qū)氲礁吡黄贩N中，初步獲得了對玉米螟有較高抗性的高粱植株。

綜上可見，影響高粱基因槍法成功的因素較多。首先，受體材料的調(diào)選及再生體系的建立是最關(guān)鍵的條件之一。其次，在微彈轟擊之后，其細(xì)胞組織受到損傷，再生能力較強(qiáng)的影響小，而再生能力較差的影響大，這是基因槍法無法避免的危害。因此，為了提高DNA轉(zhuǎn)化效率，應(yīng)對該方法進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化，如微彈的類型及大小、包被DNA后對微彈進(jìn)行監(jiān)測、受體材料抗損傷能力及再生能力等。

2.3電激法電激法誕生在20世紀(jì)80年代初。其原理是對細(xì)胞實(shí)施高壓脈沖，在細(xì)胞膜上打出一些小孔，外源的DNA等遺傳物質(zhì)通過小孔進(jìn)入細(xì)胞核，這些小孔在一段時(shí)間后能自行愈合，最終完成轉(zhuǎn)化。吳乃虎[29]最早將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)到胡蘿卜、玉米、煙草上，獲得成功。Toriyama等[30]利用該法在水稻上獲得成功。Ou-Lee等[31]于1986年首次嘗試將電激法在高粱上使用，他將編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因?qū)敫吡恢校z測了轉(zhuǎn)化結(jié)果。Battraw等[32]也用電激法將nptII基因以及uidA基因?qū)敫吡恢校玫?7個(gè)抗卡那霉素愈傷組織，但未培養(yǎng)出再生植株。

電激法的特點(diǎn)是簡單高效、費(fèi)用低廉、不需精密的設(shè)備，但缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率、成功率低，因?yàn)閷υ|(zhì)體的培養(yǎng)難以成功，目前應(yīng)用較少。在高粱轉(zhuǎn)基因初期的研究中，研究者均未獲得成功，所有該方法尚未有人應(yīng)用。

2.4花粉管通道法花粉管通道法是指將正常授粉的花柱切割后，將外源DNA等遺傳物質(zhì)涂摸在花柱上，伴隨花粉萌發(fā)DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并整合的方法。國內(nèi)楊立國[33]最早以高粱ICS-12B為對象，將高粱IS7518C基因的總DNA與BTAM428基因的總DNA混合后，通過該法進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究，F(xiàn)5代得到穩(wěn)定表達(dá)的品系23個(gè)；隨后將大豆DNA成功導(dǎo)入高粱的恢復(fù)系中，獲得的后代的品質(zhì)比對照大幅提高。Wang等[34]于2007年對該法提出改良，即花粉介導(dǎo)的超聲波轉(zhuǎn)化法，其法利用超聲波輔助處理植物細(xì)胞，其原理是利用強(qiáng)脈沖超聲波擊穿細(xì)胞膜后，細(xì)胞膜出現(xiàn)小孔洞，這些小孔洞會(huì)自動(dòng)愈合，與電激法類似，外源DNA等遺傳物質(zhì)通過小孔洞能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。他們將含nptII和uidA基因的載體先與高粱的花粉混合，在0.3 mol/L蔗糖溶液中浸泡，給予適度的超聲波處理。然后將花粉涂抹于高粱雄性不育系的柱頭上，并成功獲得轉(zhuǎn)化材料。通過檢測，發(fā)現(xiàn)上述基因已整合到高粱的正常基因組序列中，得以表達(dá)。國內(nèi)相關(guān)研究起步較晚，但也有進(jìn)展。石太淵等[26]利用花粉管通道法將PYH157基因?qū)敫吡?，得?個(gè)較抗病的植株。

該法操作簡單、周期短，能避免由于長期組織培養(yǎng)引起的體細(xì)胞變異。另外用超聲波處理可以提高成功率，所以仍被一些研究者使用。但其缺點(diǎn)是很難控制轉(zhuǎn)化基因的拷貝數(shù)。

3展望

由于高粱種質(zhì)資源中遺傳范圍狹窄以及因自交不親和性，利用遠(yuǎn)緣雜交得到新的變異成功率極低，所以利用傳統(tǒng)育種技術(shù)改良高粱品種的產(chǎn)量、品質(zhì)抗病性均不理想。由于遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)能將其他種屬的優(yōu)良農(nóng)藝性狀整合在高粱基因組中，其后代多具有較高的產(chǎn)量、抗病蟲害性、抗逆性及品質(zhì)，已被大多數(shù)育種家所認(rèn)同，可以說遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將成為國內(nèi)外高粱遺傳育種的首要目標(biāo)。

雖然高粱轉(zhuǎn)基因研究工作已取得進(jìn)展，但相比其他作物仍有差距。其遺傳轉(zhuǎn)化面臨的問題主要有：①組織培養(yǎng)方面，如培養(yǎng)基的配方、取材的時(shí)間與部位、克服再生效率低等。②尋找新的高效轉(zhuǎn)化方法。③在培養(yǎng)的過程中有些基因穩(wěn)定的表達(dá)和去除嵌合體等。隨著對其遺傳機(jī)理、各種方法研究的不斷深入，高粱遺傳轉(zhuǎn)化研究工作今后會(huì)取得更大的發(fā)展。

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