曾明鳳 康曉靜

外顯子組測(cè)序在皮膚腫瘤中的研究進(jìn)展

曾明鳳 康曉靜

皮膚腫瘤發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，環(huán)境因素和遺傳易感性是皮膚腫瘤的主要致病因素?；蛲蛔兣c皮膚腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為闡明皮膚腫瘤的發(fā)病機(jī)制提供線索。在黑素瘤、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、皮膚基底細(xì)胞癌等皮膚腫瘤中，已發(fā)現(xiàn)眾多新的突變基因。外顯子組測(cè)序作為篩查易感基因的有效平臺(tái)，覆蓋率深、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高，可以檢測(cè)皮膚腫瘤及其他多種疾病的致病基因和新的候選基因，對(duì)皮膚腫瘤的診斷、治療及預(yù)后判斷有重要意義。

皮膚腫瘤；外顯子組；多位點(diǎn)測(cè)序分型；基因；突變

1 在黑素瘤的應(yīng)用

黑素瘤在皮膚腫瘤中惡性程度高，2013年美國(guó)有 9 480 例患者死于該?。?］。2010 年，Pleasance 等［3］第一次對(duì)黑素瘤行全基因組測(cè)序，提供了腫瘤基因組體細(xì)胞突變譜。Wei等［4］為尋找黑素瘤新的候選基因，于2011年第1次將外顯子組測(cè)序應(yīng)用于黑素瘤研究，得到綜合的外顯子區(qū)變異結(jié)果。作者發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)黑素瘤的突變基因位于谷氨酸信號(hào)通路，而修飾谷氨酸信號(hào)通路可以抑制腫瘤生長(zhǎng)。除BRAF突變外，他們?cè)谶@項(xiàng)研究中還檢測(cè)到TRRAP和GRIN2A突變。TRRAP具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，編碼轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)錄域相關(guān)蛋白。該研究的167例黑素瘤樣本中有6例發(fā)生TRRAP突變（4%），該突變發(fā)生于高度保守區(qū)域，使722位絲氨酸變?yōu)楸奖彼?。用shRNA干擾突變的TRRAP基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)黑素瘤細(xì)胞凋亡率增加，提示TRRAP可能是一新的致癌基因。GRIN2A位于染色體16p13.2，編碼N-甲基-D-天冬氨酸受體。N-甲基-D-天冬氨酸受體是一類離子型谷氨酸受體，有谷氨酸受體激動(dòng)劑結(jié)合位點(diǎn)。GRIN2A在黑素瘤樣本中的突變頻率為25.2%，為本研究中突變頻率最高的基因。有學(xué)者在其他外顯子組測(cè)序研究中也發(fā)現(xiàn)相似的GRIN2A突變頻率［5-7］。另有研究表明，黑素瘤患者中有GRIN2A突變的較無(wú)GRIN2A突變的疾病進(jìn)展更快，總生存期更短，提示有無(wú)GRIN2A突變可能是判斷黑素瘤患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)［8］。

阻斷黑素瘤中有GRM3突變的MEK信號(hào)通路是治療黑素瘤的新靶點(diǎn)。GRM3是G蛋白耦聯(lián)受體的家族成員，Prickett等［9］利用外顯子組測(cè)序在黑素瘤中檢測(cè)出GRM3突變，80例黑素瘤樣本中，有13例檢測(cè)到18個(gè)GRM3非同義突變，突變率為16.3%。同時(shí)他們分析另57例標(biāo)本，確定GRM3突變熱點(diǎn)在p.Glu870Lys。此研究結(jié)合GRM3高頻突變率及系統(tǒng)的功能驗(yàn)證分析，提示GRM3為黑素瘤發(fā)生的驅(qū)動(dòng)基因。GRM3突變激活MEK信號(hào)通路，促使黑素瘤細(xì)胞增殖和遷移。由此提示阻斷黑素瘤中GRM3突變導(dǎo)致MEK信號(hào)激活可為治療黑素瘤提供新方法。

葡萄膜黑素瘤是成人眼內(nèi)最常見(jiàn)的惡性黑素瘤，其主要特征為易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，有研究顯示，約一半的患者會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移。癌基因GNAQ突變?cè)谄咸涯ず谒亓鲋泻艹Ｒ?jiàn)，但GNAQ突變通常發(fā)生于腫瘤形成早期［10］。2010 年，Harbour等［11］使用外顯子組測(cè)序在葡萄膜黑素瘤中檢測(cè)出BAP1失活性突變，研究表明，BAP1突變發(fā)生在葡萄膜黑素瘤進(jìn)展晚期及轉(zhuǎn)移性葡萄膜黑素瘤中，BAP1可能是未來(lái)治療葡萄膜黑素瘤的靶標(biāo)。

葡萄膜黑素瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移與一條3號(hào)染色單體的缺失有關(guān)，3號(hào)染色體正常的葡萄膜黑素瘤很少發(fā)生轉(zhuǎn)移，有部分單體3號(hào)染色體的葡萄膜黑素瘤預(yù)后好。Martin等［12］通過(guò)外顯子組測(cè)序，在葡萄膜黑素瘤中檢測(cè)到EIF1AX和SF3B1基因頻發(fā)突變，檢測(cè)的3例SF3B1突變組織中，2例在Arg625發(fā)生雜合錯(cuò)義突變。已有研究表明，葡萄膜黑素瘤SF3B1突變發(fā)生在Arg625位的預(yù)后好［13］。他們通過(guò)Kaplan-Meier方法分析，顯示有SF3B1和EIF1AX突變的葡萄膜黑素瘤相比沒(méi)有這些突變基因的葡萄膜黑素瘤預(yù)后好。上述研究為葡萄膜黑素瘤的預(yù)后、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。

SOX10基因在葡萄膜黑素瘤的發(fā)展中起作用。2014年，Das等［14］利用外顯子組測(cè)序在印度葡萄膜黑素瘤患者中檢測(cè)到一新的突變基因，位于4號(hào)外顯子的SOX10。轉(zhuǎn)錄因子SOX10，位于小眼球相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子上游，與小眼球相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子起協(xié)同作用［15-16］。

2 在皮膚鱗狀細(xì)胞癌（SCC）中的應(yīng)用

皮膚SCC起源于角質(zhì)形成細(xì)胞，有轉(zhuǎn)移傾向，接受免疫抑制劑者患皮膚SCC風(fēng)險(xiǎn)較健康人增加。使用BRAF或廣譜激酶抑制劑者常易出現(xiàn)鱗狀細(xì)胞增生活躍病變和皮膚SCC［17］。已有學(xué)者在散發(fā)皮膚SCC中檢測(cè)出關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)突變，如TP53、NOTCH、RAS突變；在使用激酶抑制劑誘發(fā)的皮膚SCC中存在RAS突變。South等［18］對(duì)20例皮膚SCC組織行外顯子組測(cè)序，并對(duì)91例新鮮冰凍皮膚SCC組織和21例皮膚SCC細(xì)胞系及39例使用BRAF抑制劑（威羅菲尼）產(chǎn)生皮膚SCC和鱗狀細(xì)胞增生活躍病變的組織行目標(biāo)區(qū)域測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果在外顯子組測(cè)序篩查出2萬(wàn)余個(gè)非同義突變。相比其他腫瘤存在上千個(gè)基因突變，該結(jié)果提示，皮膚SCC存在更多的突變，作者證實(shí)，皮膚SCC突變數(shù)增多的一個(gè)因素是細(xì)胞周期晚期的S期復(fù)制，其中于外顯子區(qū)篩查的68個(gè)高頻突變基因中62%有晚期S期復(fù)制。作者在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中提示，NOTCH1突變是威羅菲尼驅(qū)動(dòng)的角質(zhì)形成細(xì)胞克隆增生的必要條件。該研究還發(fā)現(xiàn)，在使用威羅菲尼的患者中，NOTCH1突變率為49%，在皮膚SCC組織中為82%，而在正常皮膚組織中為70%，表明在一定的臨床環(huán)境中，皮膚SCC瘤旁正常組織中稍低的NOTCH1突變率可促發(fā)場(chǎng)效應(yīng)。綜上表明，正常皮膚有抑制腫瘤的特征，干擾組織中主要信號(hào)通路可使起初存在的腫瘤克隆群快速擴(kuò)散，提示NOTCH1突變?yōu)槠つwSCC的早期事件。

KMT2C是近期發(fā)現(xiàn)提示侵襲性皮膚SCC預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。2014 年，Pickering等［19］對(duì) 39 例侵襲性皮膚SCC組織行外顯子組測(cè)序，檢測(cè)出23個(gè)候選驅(qū)動(dòng)基因，包括腫瘤相關(guān)基因TP53、CDKN2A、NOTCH1、AJUBA、HRAS、CASP8、FAT1、KMT2C（MLL3）及3個(gè)新的候選抑癌基因NOTCH2、PARD3及RASA1。其中KMT2C突變與皮膚SCC不良預(yù)后相關(guān)，可增加骨骼浸潤(rùn)深度。

3 在皮膚基底細(xì)胞癌（BCC）中的應(yīng)用

皮膚BCC是最常見(jiàn)的皮膚腫瘤，生長(zhǎng)較緩慢，臨床表現(xiàn)和形態(tài)多樣，很少發(fā)生轉(zhuǎn)移。Jayaraman等［20］對(duì)皮膚BCC組織行外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)皮膚BCC是突變類型最多的腫瘤。

SHH信號(hào)通路重要成員包括 SHH、PTCH1、SMO、GLI。PTCH1在通路中起負(fù)調(diào)控作用。PTCH1胞外部分與SHH粘合激活GLI轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控SHH通路靶向基因的轉(zhuǎn)錄。TP53是涉及BCC發(fā)病起源的另一基因，編碼p53蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、激活DNA損傷修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡維持基因穩(wěn)定性。該研究中PTCH1和TP53的突變率分別為75%和66%。PTCH1突變主要是非同義和剪切位點(diǎn)的突變；TP53突變主要為錯(cuò)義突變。Jayaraman等［20］提出PTCH1突變?cè)谄つwBCC發(fā)病中起核心作用。

痣樣基底細(xì)胞癌綜合征是一種常染色體顯性遺傳疾病，以皮膚基底細(xì)胞癌和多器官發(fā)育異常為主要臨床特征。為探討?zhàn)霕踊准?xì)胞癌綜合征患者并發(fā)基底細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制，Tate等［21］用外顯子組測(cè)序及Sanger測(cè)序驗(yàn)證檢測(cè)出LATS1基因突變。LATS1突變存在于浸潤(rùn)性基底細(xì)胞癌，而在表淺基底細(xì)胞癌中未檢測(cè)到。Hippo通路調(diào)控器官大小、保持細(xì)胞增殖凋亡平衡等。抑癌基因LATS1是Hippo通路的中介物質(zhì)。該研究提出，LAST1為皮膚BCC進(jìn)展的一個(gè)靶向基因，表明Hippo通路參與痣樣基底細(xì)胞癌綜合征患者并發(fā)皮膚BCC的進(jìn)展，提出Hippo通路是治療有侵襲性BCC的痣樣基底細(xì)胞癌綜合征患者的靶向目標(biāo)。

4 結(jié)語(yǔ)

利用外顯子組測(cè)序?qū)ふ移つw腫瘤的致病基因，成為近年研究皮膚腫瘤的重要方法之一。通過(guò)該技術(shù)對(duì)皮膚腫瘤的易感基因進(jìn)行篩查，為闡明皮膚腫瘤的發(fā)病機(jī)制提供了新的理論依據(jù)，在皮膚腫瘤的基因診斷和致病基因的研究及后續(xù)的功能研究中奠定了理論基礎(chǔ)，進(jìn)而為分子靶向治療、預(yù)后評(píng)估和判斷提供依據(jù)。

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Exome sequencing in skin neoplasms

Zeng Mingfeng,Kang Xiaojing.Graduate School of Xinjiang Medical University,Urumqi 830000,China

Kang Xiaojing,Email:drkangxj666@163.com

In recent years,the incidence of skin neoplasms has been increasing year by year.Environmental factors and genetic susceptibility are considered to be key pathogenic factors of skin neoplasms.Gene mutations are closely related to the occurrence and development of skin neoplasms,which have provided clues to the pathogenesis of skin neoplasms.Numerous novel mutant genes have been found in some skin neoplasms such as malignant melanoma,skin squamous cell carcinoma and skin basal cell carcinoma.As an efficient platform for screening susceptibility genes,exome sequencing has advantages of deep coverage and high accuracy,can detect pathogenic genes and novel candidate genes in skin neoplasms and other diseases,and is of great significance for early diagnosis,treatment and predilection of prognosis of skin neoplasms.

Skin neoplasms;Exome;Multilocus sequence typing;Genes;Mutation

隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，遺傳易感因素在皮膚腫瘤的發(fā)病機(jī)制中越顯重要，檢測(cè)易感基因已成為研究皮膚腫瘤發(fā)病機(jī)制的新方向。外顯子組測(cè)序是一種利用序列捕獲技術(shù)將基因組外顯子區(qū)域DNA捕獲并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法，為發(fā)現(xiàn)致病基因提供高效平臺(tái)。雖然外顯子區(qū)域僅占人類基因組約1%，但人類疾病約85%的基因突變與外顯子區(qū)域相關(guān)［1］。外顯子組測(cè)序技術(shù)具有耗時(shí)短、成本低、通量大等特點(diǎn)，可對(duì)傳統(tǒng)的焦磷酸測(cè)序不能檢測(cè)出的突變基因進(jìn)一步篩查。在尋找皮膚腫瘤致病基因方面外顯子組測(cè)序已取得顯著成果，對(duì)闡明皮膚腫瘤發(fā)病機(jī)制、獲得靶向治療目標(biāo)及預(yù)后評(píng)估等具有重要意義。

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.05.019

新疆維吾爾自治區(qū)國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（20146022）

830000烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)（曾明鳳）；新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科（曾明鳳、康曉靜）

康曉靜，Email:drkangxj666@163.com

本文主要縮寫(xiě)：UM：葡萄膜黑素瘤，SCC：鱗狀細(xì)胞癌 ，BCC：基底細(xì)胞癌

2014-11-07）