譚衛(wèi)國，王文華，周幽心，杜子威

(1 昆山市中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 昆山 215300； 2 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

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原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤組織CXCR5及其配體CXCL13表達(dá)和意義

譚衛(wèi)國1，王文華1，周幽心2，杜子威2

(1 昆山市中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 昆山 215300； 2 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

目的 檢測趨化因子受體5 (CXCR5)及其配體CXCL13在原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤組織表達(dá)水平,探討其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的可能作用。方法 分別采用免疫組化EnVision二步法和半定量RT-PCR方法，檢測CXCR5及CXCL13在5例原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤組織和10例正常腦組織中的表達(dá)。結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，CXCR5和CXCL13在腫瘤標(biāo)本中陽性表達(dá)率均為100%(5/5)，在正常腦組織中陽性表達(dá)率均為0(0/10)；半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，CXCR5和CXCL13在腫瘤標(biāo)本中全部檢出，而在正常腦組織中均未檢出。結(jié)論CXCR5/CXCL13信號通路在原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤；淋巴瘤；受體, 趨化因子；CXCL13

原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(PCNSL)是少見的腦內(nèi)非霍奇金淋巴瘤，主要累及大腦、軟腦膜、眼部及腦干，該病占原發(fā)顱內(nèi)腫瘤的3%～4%，大部分為彌漫型大B細(xì)胞淋巴瘤[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)在正常情況下缺乏B淋巴細(xì)胞存在所需要的生理環(huán)境，PCNSL為什么會發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)至今沒有明確結(jié)論。最近,趨化因子受體及其配體的作用日益受到研究者的關(guān)注,趨化因子受體5(CXCR5)及其配體CXCL13對淋巴細(xì)胞的趨化作用及對腫瘤細(xì)胞增殖等生物學(xué)行為影響的相關(guān)研究較多。本研究通過檢測CXCR5及CXCL13在PCNSL組織的表達(dá)水平, 探討其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能的作用。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源

2010年1月—2012年6月，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除并由病理證實(shí)的PCNSL標(biāo)本5例，其中男1例，女4例。5例病人血常規(guī)淋巴細(xì)胞計數(shù)及其占比均位于正常范圍，并均行骨髓穿刺檢查排除系統(tǒng)性淋巴瘤，HIV抗體檢測均陰性。對照組為正常腦組織標(biāo)本10例，均來自腦外傷行手術(shù)治療的病人。部分標(biāo)本用甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度4 μm，待行免疫組化檢測；部分標(biāo)本取下后，立即放入-187 ℃的液氮罐中保存，待行半定量RT-PCR檢測。

1.2CXCR5和CXCL13的檢測

1.2.1免疫組化檢測 采用免疫組化EnVision二步法，按試劑盒說明書操作。CXCR5、CXCL13以細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性，光鏡下隨機(jī)觀察8個高倍視野，計算陽性細(xì)胞百分比，陽性細(xì)胞百分比>10%為陽性。

1.2.2半定量RT-PCR檢測 按照Trizol說明書提取PCNSL及正常腦組織標(biāo)本總RNA,紫外線分光光度計鑒定,根據(jù)260 nm處吸光度值計算RNA濃度。取總RNA 2 μg行逆轉(zhuǎn)錄,操作步驟參照試劑盒說明。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,CXCR5、CXCL13和內(nèi)參照GAPDH引物在同等條件下擴(kuò)增，產(chǎn)物在凝膠電泳上出現(xiàn)目標(biāo)條帶視為陽性。 CXCR5上游引物序列為5′-GGTCTTCATCTTGCCCTTTG-3′，下游引物序列為5′-ATGCGTTTCTGCTTGGTTC-T-3′；CXCL13上游引物序列為5′-CTCTGCTTCTCATGCTGCTG-3′，下游引物序列為5′-CAGCTTGAGGGTCCACACAC-3′； GAPDH上游引物序列為5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物序列為5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共40個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物于20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳并進(jìn)行拍照。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化檢測

PCNSL組織CXCR5、CXCL13染色呈強(qiáng)陽性，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中見明顯棕褐色顆粒，而正常腦組織中二者染色均陰性(圖1A～D)。CXCR5和CXCL13在PCNSL腫瘤標(biāo)本中陽性表達(dá)率均為100%(5/5)，在正常腦組織中陽性表達(dá)率均為0(0/10)。

2.2半定量RT-PCR檢測

在全部腫瘤標(biāo)本中均檢出CXCR5和CXCL13 RNA表達(dá)，而在正常腦組織中均未檢出CXCR5和CXCL13 RNA表達(dá)(圖2A、B)。

3 討 論

人類的趨化因子是由50個以上氨基酸組成的小分子分泌蛋白，這些分子主要作用是免疫調(diào)節(jié)、趨化作用和活化淋巴細(xì)胞。它們因鄰近N-端的保守半胱氨酸殘基的相對位置不同而被分為CXC、CC、C和CX3C等4個亞型。趨化因子受體是由細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)、7個跨膜區(qū)和胞內(nèi)羧基末端組成的G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)19種存在于哺乳動物中的趨化因子受體，通常表達(dá)于免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞膜上。根據(jù)其所結(jié)合的配體可將趨化因子受體相應(yīng)分為CXCR、CCR、CR和CX3CR。趨化因子和對應(yīng)的趨化因子受體結(jié)合，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和移動[2]。

上世紀(jì)90年代, 在研究人伯基特淋巴瘤相關(guān)基因時發(fā)現(xiàn)了一種特殊的基因, 這也是第一種被發(fā)現(xiàn)的在淋巴細(xì)胞表面表達(dá)的GPCR，被命名為伯基特淋巴瘤受體1(BLR1)。BLR1與白細(xì)胞介素8(IL-8) 和其他中性粒細(xì)胞趨化因子的受體高度相關(guān)，與最近發(fā)現(xiàn)的HIV輔助受體CXCR4也有一定

A：PCNSL組織CXCR5染色；B：正常腦組織CXCR5染色；C：PCNSL組織CXCL13染色；D：正常腦組織CXCL13染色。免疫組化EnVision染色，400倍。

圖1 PCNSL組織和正常腦組織CXCR5及CXCL13表達(dá)

A為CXCR5電泳結(jié)果：①為正常腦組織，②～⑥為PCNSL組織；產(chǎn)物條帶位于230 bp。B為CXCL13電泳結(jié)果：①為正常腦組織，②～⑥為PCNSL組織；產(chǎn)物條帶位于200 bp。

圖2 CXCR5和CXCL13電泳結(jié)果

的相似性。根據(jù)趨化因子的命名原則， 將BLR1確定為CXCR5[3]。CXCL13是CXCR5的配體，主要分布在肝臟、血清、淋巴結(jié)和胃組織中，此外，在唾液腺和乳房組織中也有少量的分布，CXCL13編碼基因位于人染色體4q21。由于它具有吸引B細(xì)胞的能力，因此被稱為B細(xì)胞吸附因子1(BCA-1),或B細(xì)胞趨化因子(BLC)。根據(jù)趨化因子及其受體的系統(tǒng)命名法，因其受體為CXC族的趨化因子，因此被命名為CXCL13。

在淋巴器官中，大部分B細(xì)胞分布于淋巴組織濾泡中，其主要原因?yàn)榱馨蜑V泡中基質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)的CXCL13能趨化表達(dá)有CXCR5的B細(xì)胞移動、定位[4]。CXCR5及CXCL13在多種淋巴增生疾病中表達(dá)，與腫瘤形成及進(jìn)展有關(guān)。HUSSAIN等[5]研究顯示，CXCR5與CXCL13信號通路在艾滋病相關(guān)非霍奇金淋巴瘤(AIDS-NHL)的發(fā)生以及生長過程中起作用。

本研究采用免疫組化方法和半定量RT-PCR進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，CXCR5與CXCL13在腫瘤組織中均高表達(dá)，而在正常腦組織中則均無表達(dá)。說明CXCR5/CXCL13信號通路在PCNSL的病理過程中起重要作用。SMITH等[6]的研究表明，PCNSL中的惡性B淋巴細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)B細(xì)胞趨化因子CXCL13。也有研究結(jié)果表明，CXCR5與其配體CXCL13相結(jié)合，激活了Akt和ERK1/2通路[7]，而該通路與淋巴細(xì)胞活化及腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)。由此我們認(rèn)為，CXCR5/CXCL13信號通路在PCNSL中有促進(jìn)腫瘤增殖的作用。

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(本文編輯 馬偉平)

EXPRESSIONS OF CXCR5 AND ITS LIGANDS CXCL13 IN PRIMARY CENTRAL NERVOUS SYSTEM LYMPHOMA

TANWeiguo,WANGWenhua,ZHOUYouxin,DUZiwei

(Department of Neurosurgery, Kunshan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Kunshan 215300,China)

ObjectiveTo detect the expressions of chemokine receptor CXCR5 and its ligands-chemokine CXCL13-in primary central nervous system lymphoma (PCNSL) and their possible role in the occurrence and development of this disease.MethodsApplying immunohistochemical and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), the expressions of CXCR5 and CXCL13 in five cases of PCNSL and 10 cases of normal brain tissue were detected.ResultsImmunohistochemistry indicated that the expressions of CXCR5 and CXCL13 in tumor tissue were 100%(5/5), and 0 in normal brain tissue; RT-PCR showed CXCR5 and CXCL13 were all positive in the tumor tissue, and that in the normal brain tissue were negative.ConclusionCXCR5/CXCL13 signaling path plays an important role in the pathogenesis of primary central nervous system lymphoma.

central nervous dystem neoplasms; lymphoma; receptors, chemokine; CXCL13

2014-05-19;

2014-07-30

譚衛(wèi)國(1978-)，男，碩士，主治醫(yī)師。

R739.4

A

1008-0341(2015)01-0034-03