郁博，張斌，蘇磊，潘敏，臧運(yùn)書，陳宏泉

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，山東 青島 266003； 2 第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院皮膚科)

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皮膚黑素瘤細(xì)胞3種Smad的表達(dá)

郁博1，張斌2，蘇磊1，潘敏1，臧運(yùn)書1，陳宏泉1

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，山東 青島 266003； 2 第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院皮膚科)

目的 探討Smad2、Smad3、Smad4在皮膚黑素瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法 應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時熒光定量PCR方法和蛋白印跡方法，分別檢測人皮膚黑素瘤A375細(xì)胞和人正常黑素細(xì)胞中Smad2、Smad3、Smad4的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果 A375細(xì)胞中Smad2、Smad3、Smad4的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著低于人正常黑素細(xì)胞(t=2.361～4.214，P<0.01)。結(jié)論 在黑素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)/Smad信號通路中Smad2、Smad3、Smad4均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，可能參與了皮膚黑素瘤發(fā)病。

黑素瘤；黑素細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長因子β；Smad蛋白質(zhì)類

皮膚黑素瘤在皮膚腫瘤的致死率排名中一直高居首位，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移預(yù)后極差，總體5年生存率<5%。轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)/ Smad信號途徑與皮膚癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，皮膚是TGF-β作用的重要靶器官之一。目前的研究表明， TGF-β/Smad信號通路中的TGF-β、TGF-βRⅡ以及某些Smad蛋白成分在惡性黑素瘤組織中表達(dá)異常[1-2]，提示TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的改變可能參與了黑素瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究對體外培養(yǎng)的人皮膚黑素瘤A375細(xì)胞中受體活化Smad(Smad2、Smad3)和共有Smad(Smad4)的表達(dá)進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人黑素瘤A375細(xì)胞系(以下簡稱A375細(xì)胞)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)液(購自美國Gibco公司)，胎牛血清(天津?yàn)笊镏破房萍钾?zé)任有限公司)，PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM(日本TaKaRa Bio株式會社)，鼠抗人Smad2/3單克隆抗體sc-7960、兔抗人p-Smad2/3多克隆抗體sc-1176以及鼠抗人Smad4單克隆抗體sc-7966(美國Santa Cruz 生物技術(shù)公司)，兔抗人肌動蛋白(β-Actin)多克隆抗體(北京中杉金橋公司)。Chemi ImagerTM 5500型凝膠成像分析儀(美國Alpha Innotech公司)，DU 800核酸-蛋白檢測儀(美國Beckman Coulter公司)，7500 Real Time 熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)的方法，取健康成年人包皮進(jìn)行消化、分離提取人皮膚黑素細(xì)胞(以下簡稱NM細(xì)胞)[3]。NM細(xì)胞、A375細(xì)胞置含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2孵箱中，在37 ℃、飽和濕度環(huán)境下，用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.2.2反轉(zhuǎn)錄-Real-Time熒光定量PCR檢測 細(xì)胞總RNA提取參照Trizol(Invitogen公司)說明書操作步驟進(jìn)行，并對所抽提的細(xì)胞總RNA質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證。依據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計原則[4]設(shè)計引物。Smad2引物：上游5′-TTCCAGACTTTGT-GCTGTCCAGTAA-3′，下游5′-AGGGCAGAGGC-TCCACTGAGTA-3′，擴(kuò)增片段長度120 bp；Smad3引物：上游5′-AAACCAGGCTGGCTAAACAAGT-G-3′，下游5′-GCAACAGCAGCAGTGAAGGTG-3′，擴(kuò)增片段長度179 bp；Smad4引物：上游5′-GGAC-CGGATTACCCAAGACAGA-3′，下游5′-CTGCA-ATCGGCATGGTATGAAG-3′，擴(kuò)增片段長度為112 bp；GAPDH引物：上游5′-GCACCGTCAAG-GCTGAGAAC-3′，下游5′-ATGGTGGTGAAGAC-GCCAGT-3′，擴(kuò)增片段長度142 bp。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄Reagent Kit試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，42 ℃ 15 min、95 ℃ 2 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活，所得cDNA產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱中備用。Real-Time PCR反應(yīng)體系50 μL，內(nèi)含模板cDNA 200 ng。擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。分別設(shè)置融解曲線檢測融解溫度，以驗(yàn)證產(chǎn)物的特異性。Real-Time PCR檢查結(jié)果采用2-△△CT值表示[4]，其中△CTSmad=CTSmad-CTGAPDH，△△CT=△CTA375-△CTNM。

1.2.3Western blotting檢測 參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行操作[5]。分別取A375細(xì)胞和NM細(xì)胞的總蛋白40 μg，上樣至100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，再用體積分?jǐn)?shù)0.05的脫脂奶粉室溫下封閉60 min，TBS洗膜，分別加入用BSA稀釋的第一抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜后，TBS洗膜，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育1 h，TBST洗膜，DAB顯色。Smad蛋白的相對表達(dá)量以Smad與β-Actin條帶的光密度比值表示。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞中受體活化Smad mRNA的表達(dá)

與A375細(xì)胞(設(shè)為1)相比，NM細(xì)胞Smad2、3 mRNA的2-△△CT值分別為3.533±0.224和8.371±0.230， A375細(xì)胞Smad2、3 mRNA的表達(dá)水平顯著低于NM細(xì)胞。

2.2細(xì)胞中受體活化Smad蛋白的表達(dá)

NM細(xì)胞與A375細(xì)胞Smad2/3蛋白的相對表達(dá)量分別為0.274±0.055和0.158±0.112，p-Smad2/3蛋白相對表達(dá)量分別為0.602±0.095、0.159±0.081，A375細(xì)胞中Smad2/3和p-Smad2/3蛋白的表達(dá)明顯低于NM細(xì)胞(n=9，t=2.361、4.214，P<0.05)。見圖1。

2.3細(xì)胞中共有Smad mRNA的表達(dá)

與A375細(xì)胞(設(shè)為1)相比，NM細(xì)胞Smad4 mRNA 2-△△CT值為4.695±0.362， A375細(xì)胞中Smad4 mRNA表達(dá)水平顯著低于NM細(xì)胞。

2.4細(xì)胞中共有Smad蛋白的表達(dá)

NM細(xì)胞與A375細(xì)胞Smad4蛋白相對表達(dá)量分別為0.477±0.072和0.152±0.121，A375細(xì)胞中Smad4蛋白的表達(dá)明顯低于NM細(xì)胞(n=9，t=3.522，P<0.01)。見圖2。

圖1 Western blotting檢測A375細(xì)胞與NM細(xì)胞Smad2/3及p-Smad2/3蛋白的表達(dá)

圖2 Western blotting檢測A375細(xì)胞與NM細(xì)胞Smad4蛋白的表達(dá)

3 討 論

Smad蛋白家族是TGF-β超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在TGF-β/Smad受體下游的信號傳導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵調(diào)控作用。根據(jù)其功能的不同可以分為3類：①受體活化Smad蛋白，主要包括Smad1～Smad3、Smad5和Smad8等，其中Smad2和Smad3介導(dǎo)TGF-β1和激活素的信號，Smad1、Smad5、Smad8則介導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的信號；②共有Smad蛋白，即Smad4，該蛋白參與所有TGF-β家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；③抑制性Smad蛋白，主要有Smad6和Smad7，是TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路負(fù)性調(diào)節(jié)因子，主要通過阻斷受體活化Smad蛋白與TGF-β受體或共有Smad蛋白的結(jié)合發(fā)揮作用[6]。

TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路中的多項(xiàng)異常與一些不同病理類型實(shí)體腫瘤細(xì)胞(如胃腸癌、肝癌、肺癌、食管癌)的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。既往研究結(jié)果顯示，MDH4(編碼Smad4蛋白)在腫瘤中頻發(fā)突變，其中在胰腺癌、結(jié)直腸癌中Smad4基因突變頻率較高，基因的突變和缺失引起Smad4蛋白失活[7]。MADH2 (編碼Smad2蛋白)在某些腫瘤中有一定突變，肺癌中也發(fā)現(xiàn)了Smad2基因的突變，但突變頻率要低于Smad4基因。在直腸癌、頭頸部腫瘤中均發(fā)現(xiàn)Smad2突變，肝細(xì)胞癌存在Smad2和Smad4基因突變。在Smad2和Smad4的MH2結(jié)構(gòu)域經(jīng)常發(fā)生點(diǎn)突變和移碼突變，產(chǎn)生早熟的蛋白。Smad4的MH2結(jié)構(gòu)域突變破壞了蛋白的核心結(jié)構(gòu)，從而不能形成Smad蛋白復(fù)合體，阻斷了受體依賴的受體活化Smad蛋白磷酸化作用或產(chǎn)生不穩(wěn)定的Smad蛋白，并可以引發(fā)MH1和MH2親和力增加，進(jìn)而阻滯TGF-β對癌細(xì)胞的抑制作用[8]。

目前研究結(jié)果顯示，TGF-β/Smad信號通路中TGF-β、TGF-βR及部分Smad蛋白成分在惡性黑素瘤組織中表達(dá)異常[1-2]。本研究結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的人黑素瘤A375細(xì)胞出現(xiàn)TGF-β受體活化Smad(Smad2、3)及共有Smad(Smad4)表達(dá)水平的下調(diào)。在TGF-β/Smad信號通路中，細(xì)胞內(nèi)的受體活化Smad是否正常表達(dá)是TGF-β信號能否順利傳導(dǎo)的關(guān)鍵因素。如果Smad2、3表達(dá)水平降低或缺失，會加劇TGF-β/Smad信號下傳受阻。而Smad4可以與Smad2、3發(fā)揮協(xié)同作用，共同參與調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號的下傳。一旦出現(xiàn)細(xì)胞Smad4表達(dá)的下調(diào)或缺失時，也可以干擾TGF-β信號的下傳。失去TGF-β抑制作用的黑素瘤細(xì)胞在癌基因啟動和抑癌基因功能喪失等其他多種相關(guān)因素的參與下，可出現(xiàn)異常的失控性增殖，導(dǎo)致黑素瘤細(xì)胞病理改變的形成。

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(本文編輯 馬偉平)

EXPRESSIONS OF THREE KINDS OF SMAD IN CUTANEOUS MELANOMA

YUBo,ZHANGBin,SULei,PANMin,ZANGYunshu,CHENGHongquan

(Department of Dermatology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the expressions of Smad2, Smad3 and Smad4 in cutaneous melanoma.MethodsReverse transcription-real time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting were utilized to detect the expressions of A375 cell line in cutaneous melanoma and Smad2, Smad3 and Smad4 in normal melanocytes.ResultsThe expressions of Smad2, Smad3 and Smad4 mRNA of A375 cells line were significantly lower than human normal melanocytes (t=2.361-4.214,P<0.01).ConclusionIn TGF-β/Smad signaling pathways, the down regulation of Smad2, Smad3 and Smad4 may involve in the pathogenesis of cutaneous melanoma.

melanoma; melanocytes; transforming growth factor beta; Smad proteins

2014-07-02;

2014-09-18

山東省科技發(fā)展計劃項(xiàng)目(2011YD18012)，山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2010HM022)，山東省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(2011-199)

郁博(1976-)，男，博士，主治醫(yī)師。

臧運(yùn)書(1963-)，男，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師。

R739.5

A

1008-0341(2015)01-0026-03