秦 娜 魏立偉

(河南省洛陽正骨醫(yī)院，洛陽，471000)

人參總皂苷對野百合堿誘導的大鼠右室肥厚及ERK通路的影響

秦 娜 魏立偉

(河南省洛陽正骨醫(yī)院，洛陽，471000)

目的:觀察人參總皂苷(Total Ginsenosides，TG)對野百合堿(Monocrotaline，MCT)所致大鼠右心室肥厚的影響并探討其與細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)信號通路的關系。方法:雄性SD大鼠隨機分為正常對照組，MCT模型組，TG 20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)、60 mg/(kg·d)劑量組，各組動物均給藥18 d。測定各組大鼠的右室肥厚指數(shù)(RVHI)、右心重/體重(RVW/BW);透射電鏡觀察心肌細胞超微結構的改變;Real time RT-PCR檢測心肌組織ERK1mRNA的表達，Western blotting檢測心肌組MKP-1蛋白質的表達。結果:TG預防給藥均使RVHI、RV/BW表達明顯降低，改善超微結構損傷，降低心肌組織ERK1mRNA和提高MKP-1蛋白質的表達。結論:TG能明顯改善MCT誘導的大鼠右心室肥厚，其抗心肌肥厚作用至少與抑制ERK1信號轉導通路有關。

人參總皂苷;右室肥厚;細胞外信號調節(jié)激酶;絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1

心肌肥厚是心肌對多種心血管刺激的適應性反應，早期有一定代償意義。但長期的心肌肥厚將發(fā)展為心力衰竭、心律失常和猝死[1]。右室肥厚、右心力衰竭是肺動脈高壓死亡的主要原因[2]。因此，逆轉右室肥厚是提高患者生存率和生存質量的重要環(huán)節(jié)。

人參主要活性物質人參皂苷有阻滯鈣離子通道[3-4]、抗血管平滑肌細胞增殖[5-6]、調節(jié)一氧化氮(Nitric Oxide，NO)的釋放[7-8]等作用。我們以前的研究表明，人參皂苷Rb1和Rg1能顯著對抗大鼠心肌肥厚的作用，其機制可能與抑制鈣調神經磷酸酶和絲裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK)信號通路有關[9-10]，人參總皂苷的各單體間結構相似，推測若干成分可能具有類似單體的抗心肌肥厚作用，而且人參總皂苷相對便宜，來源豐富，更易于開發(fā)利用，本研究擬探討人參總皂苷(Total Ginsenosides，TG)對MCT誘導的大鼠右心室肥厚作用，為傳統(tǒng)中藥人參的開發(fā)利用提供基礎藥理學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD(Spragye-Dawley)大鼠，清潔級，體重(200±20) g。由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供(許可證號:SCXK20020003)。

1.1.2 試劑與材料 TG由北京天然藥物研究院趙銳教授惠贈(用JTY-300型反相制備色譜固定相分離，純度>93%)。MCT(批號:106K1602，美國Sigma公司);ERK1、β-action和逆轉錄試劑盒由大連寶生物工程有限公司;SYBR? GREEN PCRMaster Mix(ABI公司)。

1.1.3 實驗儀器 實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司);逆轉錄(儀德國Eppendorf公司)，Model 550型酶標儀(美國BIO-Tek公司);Icycler熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)

1.2 實驗方法

1.2.1 MCT模型制備及實驗分組 實驗大鼠隨機分成正常組對照、MCT模型組、TG低、中、高劑量組，每組10只。除正常對照組外其他各組單次腹腔注射(i.p.)2%MCT 60 mg/kg，24 h后TG低、中、高劑量組分別腹腔注射TG 20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)、60 mg/(kg·d)，給藥共18 d。

1.2.2 右室肥厚指數(shù)測定 稱右室(RV)和左室及室間隔(LV+S)的重量，計算右心肥厚指數(shù)，即RVHI=RV/(LV+S)以及RV/BW。

1.2.3 右心肌組織超微結構的觀察 取新鮮右心室組織約1 mm3，電鏡液中固定，環(huán)氧樹脂包埋，鈾鉛雙染色，超薄(600A)切片，日立H-600型透射電鏡觀察各組標本細胞核、細胞器、線粒體等超微結構的變化。

1.2.4 Real-Time RT-PCR檢測心肌組織ERK1mRNA的表達 右心肌組織總RNA的提取及逆轉錄操作按試劑盒說明進行。以PCR儀逆轉錄后，RT-PCR儀進行擴增。β-actin引物:正向5'-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3'，反向5'-TAGAGCCACCAATCCACACA-3'，擴增產物長度104 bp，ERK1引物正向5'-GTTCCCAAACGCTGACTCCAA-3'，反向5'-GTAAGTCGTCCAGCTCCA

TGTCAA-3'，擴增產物長度182 bp，PCR反應條件:95 ℃，10 min進入循環(huán);95 ℃，15 s、60 ℃，1 min，循環(huán)45次。以β-actin為內參，用相對定量法計算ERK1 mRNA的表達水平。以循環(huán)閾值(Ct值)為統(tǒng)計參數(shù)，用目的基因表達/β-actin基因表達對ERK1 mRNA進行相對定量。

1.2.5 Western blotting檢測心肌組織中MKP-1蛋白表達 右心室組織約100 mg經T-PERTM蛋白提取混合液處理后，取上清液用Bradford蛋白濃度檢測試劑盒進行蛋白定量。以10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電壓36 V，3 h電轉。封閉、分別加MKP-1一抗(1∶400)及內參anti-β-actin(1∶2 000)，孵育2 h;二抗為辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，孵育1 h后通過BCIP/NBT進行顯色，采用Syngene凝膠成像系統(tǒng)分析。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態(tài)的變化 正常對照組在用藥前后一般狀態(tài)無明顯差異，BW18 d較前增加了36%，MCT模型組大鼠在腹腔注射MCT 7 d出現(xiàn)活動明顯減少，毛發(fā)直立，口唇發(fā)紺，呼吸急促，食欲下降。18 d處死開胸，可見肺表面凹凸不平，彈性差，并可見灶性瘀血;BW較前增加了2%，TG各預防給藥組一般狀態(tài)較MCT模型組明顯好轉(見圖1)。

圖1 TG40 mg/kg預防給藥對大鼠體重的影響

2.2 TG對右心室肥厚指數(shù)的影響 與空白對照組比較，MCT模型組在腹腔注射MCT18 dRVHI、RVW/BW分別增加了30%、44%，TG各預防給藥組與MCT模型組比較，上述指標明顯降低(P<0.01)，但TG各劑量組之間無統(tǒng)計學意義。(見表1)

表1 TG預防給藥對野百合堿誘導心肌肥厚大鼠肥厚指標的影響

注:與對照組比較，##P<0.01；與MCT組比較，**P<0.01。

2.3 TG對心肌肥厚大鼠心肌超微結構的影響 正常大鼠的超微結構無異常表現(xiàn)(C)，MCT模型組大鼠心肌組織出現(xiàn)閏盤中斷，肌絲稀疏，灶性溶解，并出現(xiàn)空白水腫，收縮帶形成;線粒體增生，腫脹變形，嵴排列紊亂、溶解，巨線粒體形成;細胞核增大，核周間隙增寬，核仁增多(M)。TG40、60 mg/(kg·d)預防給藥18 d上述變化明顯改善，肌絲排列尚可，線粒體輕度肥大，基質水腫不明顯，未見閏盤中斷和空白水腫，但線粒體仍然明顯增生(M〞、H)。(見圖2)

2.4 Real time RT-PCR檢測ERK1mRNA的表達

RT-PCR檢測結果顯示，正常對照組大鼠RV中ERK1mRNA表達較低。MCT促進ERK1mRNA的表達明顯增加，與正常對照組比較，ERK1mRNA增加了2.6倍(P<0.01)。TG預防給藥均明顯抑制ERK1mRNA的表達，與MCT模型組比較，TG 20 mg/kg使ERK1mRNA的表達減少29.3%(P<0.01)，各劑量組間差異無統(tǒng)計學意義。(見圖3)

圖2 TG預防給藥對心肌細胞超微結構的影響

圖3 TG預防給藥對MCT誘導心肌肥厚大鼠RV中ERK1mRNA表達的影響

2.5 TG預防給藥對MCT誘導心肌肥厚大鼠RV中MKP-1蛋白質的影響 Western blotting實驗結果表明，與正常對照組比較，MCT模型組MKP-1蛋白的表達稍有增高，TG預防給藥能使提高MKP-1蛋白的表達，與MCT模型組比較，低、中、高劑量組分別增加了11%、81%、190%，但僅有中、高劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(見圖4、圖5)

3 討論

目前，心肌肥厚發(fā)展為心力衰竭在各種心血管病癥中死亡率占居首位[11]。故對其預防和治療的研究顯得尤為重要。本實驗利用大鼠MCT右室肥厚模型，觀察了TG對心肌肥厚的作用并分析其可能的作用機制。

MCT右室肥厚模型被廣泛用于非原發(fā)于心臟的右心室肥厚和心力衰竭研究[12]。本實驗結果表明，大鼠在單次腹腔注射MCT 18 d后，RVHI、RVW/BW均明顯高于正常對照組，說明MCT右室肥厚的模型制備成功，TG預防給藥組能明顯減輕上述指標的增高，其中，由于模型組給藥前后BW無差別甚至略低，與相應正常對照組比較明顯偏輕，RV/BW可能因模型組體重減輕而產生一定的非特異效應，但RVHI的明顯升高強烈提示RVH的發(fā)生。單從檢測指標上看，TG高劑量給藥組比低劑量效果更為明顯，然統(tǒng)計學分析表明，各劑量組間無明顯差異。另外，心肌組織透射電鏡結果顯示模型組心肌組織出現(xiàn)了心肌肥厚的病理改變，而TG能明顯改善MCT所引起的心肌超微結構的損傷，提示TG對右室的心肌線粒體具有保護作用。以上結果提示TG具有減輕MCT引起心肌肥厚的作用。

圖4 Western blot檢測各組大鼠右心室MKP-1蛋白質表達

注:A為正常對照組，B為模型組，C為TG低劑量組，D為TG中劑量組，E為TG高劑量組

圖5 TG對野百合堿誘導大鼠右心室MKP-1蛋白質表達變化的影響

結合以上實驗結果，本研究進一步探討了TG預防心肌肥厚可能的作用機制。MAPK是調節(jié)心肌肥厚的重要信號通路，被認為是多種細胞外信號引起細胞增生、肥大的細胞內信息傳遞的匯聚點或共同通路，MAPK其成員ERKs與細胞生長、分化和增殖的調控關系最為密切，參與多種刺激引起的心肌肥大[13]?；罨腗APK主要因被其磷酸酶去磷酸化而失活，在心肌細胞，MKP-1是重要的MAPK磷酸酶，對MAPK的活性調節(jié)具有重要意義[14]。另有研究表明，許多人參皂苷單體(Rb1、Rc、Re、Rg1、Rg3)均能降低TPA誘導的ERK1/2的激活，降低ERK1/2蛋白表達水平[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，MCT模型組ERK1mRNA水平表達顯著增高，MKP-1蛋白水平稍有增高，與正常對照組比較無統(tǒng)計學意義，TG低、中、高預防給藥都能降低ERK1mRNA的表達，同時提高MKP-1蛋白表達水平，從而增加對ERK1的滅活，延緩心肌肥厚的發(fā)展進程。需要指出的是，TG對ERK1mRNA表達的影響各個劑量組之間差異無統(tǒng)計學意義，但對MKP-1蛋白水平的影響各個劑量組之間差異有統(tǒng)計學意義，能劑量依賴性提高蛋白的表達，其原因可能是本實驗所用ERK1的引物不是針對其活性部分的;機體對ERK1活性的調節(jié)發(fā)生在蛋白水平。TG抗心肌肥厚的作用至少與調控MAPK信號通路有關。

心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的復雜的病理生理過程，TG抗心肌肥厚的作用除影響MAPK信號通路外，還可能與其他信號通路有關，值得進一步研究。

[1]Berenji K，Drazner MH，Rothermel BA，et al.Does load-induced ventricular hypertrophy progress to systolic heart failure?[J].Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol，2005，289(1)：H8-H16.

[2]Voswinckel R，Hoeper MM，Kramm T，et al.Right heart failure in chronic pulmonary hypertension and acute pulmonary embolism[J].Internist(Berl)，2012，53(5):545-556.

[3]Zhong GG，Sun CW，Li YY，et al.Calcium channel blockade and anti-free-radical actions of panaxadiol saponins Rbl，Rb2，Rb3，Rc，and Rd[J].Acta Pharmacologica Sindca，1995，16(3):255-260.

[4]Jiang Y，Liu W，Wang XM，et al.Calcium channel blockade and anti-free-radical actions of panaxatriol saponins in cultured myocardiocytes[J].Acta Pharmacologica Sinica，1996，17(2):138-141.

[5]Zhang S，Deng J，Gao Y，et al.Ginsenoside Rb1inhibits the carotid neointimal hyperplasia induced by balloon injury in rats via suppressing the phenotype modulation of vascular smooth muscle cells[J].Eur J Pharmacol，2012，685(1-3):126-132.

[6]Huang J，Li LS，Yang DL，et al.Inhibitory Effect of Ginsenoside Rg1 on Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation Induced by PDGF-BB Is Involved in Nitric Oxide Formation[J].Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012:314-395.

[7]Ahn HY，Hong SY，Kim JY，et al.Panax ginseng extract rich in ginsenoside protopanaxatriol offers combinatorial effects in nitric oxide production via multiple signaling pathways[J].Springerplus，2013，2(1):96.

[8]J Yu，M Eto，M Akishita，et al.Signaling pathway of nitric oxide production induced by ginsenoside Rb1 in human aortic endothelial cells：a possible involvement of androgen receptor[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，353(3):764-769.

[9]Jiang QS，Huang XN，Yang GZ，et al.Inhibitory effect of ginsenoside Rb1 on calcineurin signal pathway in cardiomyocyte hypertrophy induced by prostaglandin F2[J].Acta Pharmacologica Sinica，2007，28(8):1149-1154.

[10]Deng J，Lv XT，Wu Q，et al.Ginsenoside Rg1 inhibits rat left ventricular hypertrophy induced by abdominal aorta coarctation：Involvement of calcineurin and mitogen-activated protein kinase signalings[J].European Journal of Pharmacology，2009，608(1-3):42-47.

[11]Blozik E，Eisele M，Scherer M.Improvements in survival in patients with heart failure[J].Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz，2012，55(4):552-557.

[12]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:1030-1032.

[13]Bueno OF，Molkentin JD.Involvement of extracellular signal-regulated kinase 1/2 in cardiac hypertrophy and cell death[J].CircRes，2002，91(9):776-781.

[14]Fuller S J，Davies E L，Gillespie B J，et al.Mitogen-activated protein kinase phosphatase 1 inhibits the stimulation of gene expression by hypertrophic agonists in cardiac cardiomyocytes[J].Biochem J，1997，323(Pt 2):313-319.

[15]Surh YJ，Lee JY，Choi KJ，et al.Effects of selected ginsenosides on phorbol ester-induced expression of cyclooxygenase-2 and activation of NF-κB and ERK1/2 in mouse skin[J].Ann.N.Y.Acad.Sci，2002，973:396-401.

[16]Jung SH，Woo MS，Kim SY，et al.Ginseng saponin metabolite suppresses phorbol ester-induced matrix metalloproteinase-9 expression through inhibition of activator protein-1 and mitogen-activated protein kinase signaling pathways in human astroglioma cells[J].Cancer，2006，118(2):490-497.

(2014-04-24收稿 責任編輯：王明)

Effects of Total Ginsenosides on Monocrotaline-induced Cardiac Hypertrophy and ERK Signaling Pathway in Rats

Qin Na,Wei Liwei

(LuoyangOrthopedicsTraumatologicalHospital,Luoyang471000,China)

Objective:To investigate the inhibition of total ginsenosides (TG) on right ventricular hypertrophy induced by monocrotaline(MCT) and explore the effects of TG on extracellular-regulated kinase(ERK) signal transduction in rat.Methods:Male Sprague Dawley rats were randomly divided into the normal group,MCT group and 20 mg/(kg·d),40 mg/(kg·d),60 mg/(kg·d) dose TG treatment group.Ventricular hypertrophy index(RVHI) was measured by the weight ratio of RV to left ventricle plus septum,and by observing the ultrastructural changes of myocardial cell with transmission electron microscope.The ERK1 mRNA and mitogen-activated protein kinase phosphatase-1(MKP-1) protein expression of right ventricle tissue were detected by real-time RT-PCR,Western blotting.Results:TG treatment could significantly reduce RVHI,RVW/BW.The swollen and misshapen mitochondria could be improved by TG.TG also could down-regulate ERK1 mRNA expression and enhance MKP-1 protein expression.Conclusion:TG could significantly attenuate MCT-induced cardiac hypertrophy in rat by suppressing ERK Signaling pathway.

Total ginsenosides; Right ventricular hypertrophy; Extracellular-regulated kinase; Mitogen-activated protein kinase phosphatase-1

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.04.023