李青松 黃 陽 郎永英 毛春芹 陸兔林 ▲

江蘇省昆山市中醫(yī)院 (昆山 215300)

HPLC同時測定復方歸枳顆粒中四種成分的含量

李青松 黃 陽 郎永英△毛春芹△陸兔林△ ▲

江蘇省昆山市中醫(yī)院 (昆山 215300)

目的：建立同時測定復方歸枳顆粒中阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷4種成分的反相高效液相色譜法。方法： 采用高效液相色譜法(HPLC)。色譜條件：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；流動相：乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液。流速：1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長218 nm。結果：阿魏酸在0.0125～0.0642 mg/mL、柚皮苷在0.0801～0.4005 mg/mL、橙皮苷在0.0352～0.1760 mg/mL、新橙皮苷在0.0848～0.4240 mg/mL范圍內(nèi)均成良好的線性關系；相關系數(shù)分別為0.9995、0.9998、0.9996、0.9997；平均回收率分別為100.15%、97.70%、99.05%、97.75%，RSD分別為1.97%、2.05%、2.57%、1.34%。結論：該方法簡便、準確、重現(xiàn)性好，可作為該顆粒制劑的質量控制方法。

復方歸枳顆粒為醫(yī)院復方中藥制劑，由當歸、枳殼、山茱萸、續(xù)斷、訶子5味藥制成，具有補血養(yǎng)血，調(diào)經(jīng)止痛之功效，現(xiàn)臨床較多用于女性血虛經(jīng)閉、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)等癥，均取得良好的治療效果，達到了標本兼治。當歸是方中君藥，有補血調(diào)血之效，主要有效成分為阿魏酸；配枳殼以益氣養(yǎng)血，氣血同調(diào)，益沖任之脈，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等黃酮類成分是其主要藥效成分[1-4]。通常含量測定只測復方中的一種成分，不能全面反映復方質量，并且未見報道同時測定本方多種有效成分含量的文獻[5]。為了提高本品的內(nèi)在質量標準，本文建立了高效液相色譜法(HPLC)同時測定復方歸枳顆粒中橙皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷的含量，分離效果理想，方法靈敏但穩(wěn)定，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥 1.1 儀 器 采用配有VWD可變波長檢測器的Agilent 1100 高效液相色譜儀，應用色譜工作站為Chem Station ；由淮陰漢邦科技有限公司生產(chǎn)的Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；由梅特勒-托利多公司生產(chǎn)的MS105DU型電子分析天平；由昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)的KQ-600DB型超聲波清洗器。

1.2 試 藥 復方歸枳顆粒(醫(yī)院自制，規(guī)格：10 g/袋，批號為140302、140304、140306)；對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，分別為阿魏酸(批號0773-9708)、柚皮苷(批號110722-200610)、橙皮苷(批號110721-200211)、新橙皮苷(批號110721-200206)；所用試劑乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他均為分析純。

2 方法與結果 2.1 色譜方法 色譜柱：Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液；檢測波長218nm；流速：1.0mL/min；柱溫30℃；進樣量10 μL[5-7]。

2.2 制備對照品的混合液 分別精密稱取橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸對照品適量，置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別制成濃度為每1mL含橙皮苷0.669mg、柚皮苷1.802mg、新橙皮苷1.218mg、阿魏酸1.278mg的對照品儲備液。再分別精密吸取適量上述溶液置于容量瓶中5mL，加甲醇稀釋至刻度，即得對照品混合液(分別為阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷為64.4μg/mL、396.0μg/mL、168μg/mL、404μg/mL)。

2.3 供試品溶液的制備 取本品約2.5 g，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇20 mL，稱重；超聲處理20 min，放冷至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，濾液用微孔濾膜過濾，即得。

2.4 陰性對照液的制備 按照歸枳顆粒的處方及制備工藝，制成不含當歸、枳殼的樣品。方法同上制成缺當歸、枳殼的陰性樣品溶液。

2.5 陰性對照試驗 分別精密吸取對照品混合液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，在上述色譜條件下進樣；結果表明，供試品溶液中被測組分與其它成分分離良好，缺當歸、枳殼的陰性對照品無干擾峰。見圖1。

1.阿魏酸 2.柚皮苷 3.橙皮苷 4.新橙皮苷A.對照品混合液 B.供試品溶液 C.陰性對照溶液圖1 高效液相色譜圖

2.6 線性關系考察 分別精密量取對照品混合液0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL 、0.6 mL、0.8 mL～1 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，混合對照品母液單獨為一組；分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，同時記錄并計算峰面積。對數(shù)據(jù)進行回歸分析，將進樣濃度x(mg/mL)設為橫坐標，將峰面積y設為縱

坐標。分別求得阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷標準曲線方程、相關系數(shù)和線性范圍，結果見表1。

表1 四種有效成分的線性方程、相關系數(shù)及線性范圍

2.7 精密度試驗 每次取對照品混合液10 μL，連續(xù)進樣6次，測得阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面積并計算，RSD分別為1.18 %，1.92 %，2.33%，1.66 %。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取批號為130302的供試品溶液，每隔2h進樣一次，共6次，結果阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為2.51%、0.66%、1.09%、0.82%、表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復性試驗 取批號為130302的供試品溶液，按文中色譜條件測定6次，阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均含量分別為0.1170 mg/g、2.864 mg/g、0.4422 mg/g、2.1287 mg/g；RSD分別為2.70%、1.60%、2.64%、1.89%，表明該法具有良好的重現(xiàn)性。

2.10 加樣回收率 分別精密稱取阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品適量，置于同一量瓶中，分別制成質量濃度為0.1685 mg/mL、3.5677 mg/mL、0.5147 mg/mL、2.5263 mg/mL的對照品混合液。取已知含量的批號為140302的樣品9份，每份約1.25 g，置具塞錐形瓶中，分別加入對照品混合液0.8 mL、1 mL、1.2 mL，按樣品測定項下方法測定，計算各自回收率。阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均加樣回收率依次為100.15%、97.70%、99.05%、97.75%，RSD分別為1.97%、2.05%、2.57%、1.34%。

2.11 樣品測定 分別取批號為140302 、140304、 140306的樣品，精密稱取約2.5 g制成供試品溶液，再取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，照上述色譜條件測定，計算，結果見表2。

表2 歸枳顆粒樣品含量測定結果

3 討 論 復方歸枳顆粒為我院多年臨床經(jīng)驗方，具有養(yǎng)血補血、調(diào)經(jīng)止痛等療效，原醫(yī)院制劑質量標準中只有阿魏酸含量的簡單測定項，但作為中藥復方制劑，單一成分并不能很好控制其質量，因此，本文采用HPLC法同時測定制劑中阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷4種成分的含量，為復方歸枳顆粒質量標準的制訂提供科學依據(jù)，確定合理檢測限度[8-9]。

由于復方歸枳顆粒成分復雜，其主要有效成分的紫外吸收差異很大；我們?yōu)閷旌蠈φ掌愤M行了吸收光譜掃描以保證分離、檢測的良好性。通過與單一對照品比較，除阿魏酸峰外，其他檢測成分的峰在310nm處靈敏度均大幅降，且在210 nm處基線不穩(wěn)定，只有在218 nm處各種被測組分都能出峰，低含量組分中阿魏酸的分離度適中且檢測靈敏度、峰型也較好[8]。分析認為，將218 nm作為檢測波長，才能實現(xiàn)吸收強、干擾小的目的。

為了保證樣品中檢測成分能被充分提取，查閱文獻 ，對同一批樣品分別進行了提取溶劑(甲醇、乙醇)、方法(超聲提取、回流提取)、時間選擇試驗(20、30、40 min)[10-14]。結果發(fā)現(xiàn)，甲醇不僅提取效率高，而且供試品進入液相雜質干擾少；超聲提取與回流提取方法，以及提取時間對提取率均無顯著差異。綜合考慮提取率、成本等因素，選定加甲醇適量，超聲30min。

經(jīng)過甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水、乙腈-甲醇-磷酸水溶液等4種流動相系統(tǒng)試驗，發(fā)現(xiàn)只有乙腈-甲醇-磷酸水溶液作為流動性時，基線平穩(wěn)度好，待測化合物靈敏度也更高，尤其是阿魏酸的峰型好，其余各峰分離效果也較佳，分離度均達到1.5以上，故選擇乙腈-甲醇- 0.1 %磷酸水梯度為流動相進行洗脫，但注意在測定過程中要保持其穩(wěn)定。

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(收稿2014- 09-01；修回2014-09-17)

阿魏酸/分析 柚皮苷/分析 橙皮苷/分析 新橙皮苷/分析 色譜法，高壓液相

R284

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.01.050

△南京中醫(yī)藥大學藥學院(南京 210023)

▲通訊作者