冒有平 江蘇省如皋市中醫(yī)院藥劑科(如皋 226500)

高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方黃芪顆粒中黃芪苷的含量

冒有平 江蘇省如皋市中醫(yī)院藥劑科(如皋 226500)

目的：探討高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方黃芪顆粒中黃芪苷的含量。方法：色譜條件：流動(dòng)相為甲醇-水-乙腈，流速為1mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，進(jìn)樣量10μL，柱溫35℃。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=013.614X-1.4897，相關(guān)系數(shù)R=0.9979；本實(shí)驗(yàn)方法精密度符合要求，回收率高，穩(wěn)定性強(qiáng)，黃芪苷在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方黃芪顆粒中黃芪苷的含量為3.39mg/5g。結(jié)論：高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方黃芪顆粒中黃芪苷的含量操作簡(jiǎn)便迅速，精密度和穩(wěn)定性均較理想，回收含量高，可為測(cè)定中藥中黃芪苷物質(zhì)含量提供方法依據(jù)。

復(fù)方黃芪顆粒是臨床上的常用藥，具有健脾益腎，疏肝活血，清熱利濕之功效。黃芪苷是復(fù)方黃芪顆粒中主要活性物質(zhì)之一[1]。黃芪苷具有降壓、鎮(zhèn)驚、鎮(zhèn)痛作用，能增加血漿中cAMP和再生肝DNA的含量[2]；也能促進(jìn)胰島素的分泌，激活延長(zhǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的消失[3]。眾所周知，在當(dāng)前我國藥物的發(fā)展進(jìn)程中，中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的研究是指導(dǎo)臨床合理用藥和保證中藥材質(zhì)量的主要手段[4-5]。同時(shí)我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)的是中藥的整體效應(yīng)，對(duì)單個(gè)成分的作用機(jī)制研究較少[6]。由于黃芪苷具有顯著的生物活性，因此高效測(cè)量黃芪苷的含量工藝有重要的意義[7]。當(dāng)前黃芪苷的測(cè)定方法有薄層色譜法(TLC)、毛細(xì)管電泳法(CZE)等，不過上述方法在含量測(cè)定中都普遍存在靈敏度不高、重復(fù)性不強(qiáng)的現(xiàn)象[8]。高效液相色譜在當(dāng)前生物樣品的測(cè)定中具有靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本文具體探討了高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方黃芪顆粒中黃芪苷的含量?jī)r(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法 1.1 儀器與試劑 復(fù)方黃芪顆粒(四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字Z20003380)，對(duì)照品本均來自本實(shí)驗(yàn)組從復(fù)方黃芪顆粒中分離得到的黃芪苷，分析純甲醇來自北京化工試劑公司，分析乙腈來自Sigma公司。高效液相色譜(HPLC)選擇Waters 2695，配套有UV waters 2996檢測(cè)器，色譜柱為SUNFIRE C18(5μm 4.8×150mm)，KQ-700DB超聲波清洗器來自昆山市超聲儀器有限公司，F(xiàn)TIR-8400S型紅外光譜儀與GSP-84-02型磁力恒溫?cái)嚢杵鞫紒碜詬u津公司。

1.2 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇-水-乙腈；流速：1mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：35℃。黃芪苷純品HPLC色譜圖見圖1。

圖1 黃芪苷純品HPLC色譜圖

1.3 對(duì)照品的制備 精密稱取黃芪苷標(biāo)準(zhǔn)品20mg，分別精確配成0.4mg/mL、0.8mg/mL，1.2 mg/mL，1.6 mg/mL，2.0 mg/mL的溶液，搖勻，分別經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，備用。

1.4 供試品的制備 取復(fù)方黃芪顆粒200g，分別用1500mL甲醇浸泡過夜回流提取，分離得到復(fù)方黃芪顆粒粗提物5g，甲醇溶解，選擇二氯甲烷甲醇10：1(200 mL)和4：1(400 mL)洗脫，提取后溶于50mL甲醇作為黃芪苷的供試品。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別精密吸取0.15 mL，0.30 mL，0.45 mL，0.60 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各加入無水乙醇定容至0.75 mL，置于冰浴中加入7.5 mL體積分?jǐn)?shù)為72%的硫酸搖勻，在30min內(nèi)，于波長(zhǎng)250nm處測(cè)定吸光度，所求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=013.614X-1.4897，相關(guān)系數(shù)R=0.9979，線性范圍為10.2-102μg/ mL-1，表明線性回歸較好。

2 結(jié) 果 2.1 精密度試驗(yàn) 取已配好的對(duì)照品黃芪苷溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為5μL，記錄各峰面積，計(jì)算RSD值分別為1.6%、1.7%、1.8%、1.6%，1.1%和1.7%，表明本實(shí)驗(yàn)方法精密度符合要求。

2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取復(fù)方黃芪顆粒的粗提物溶解，在0、4、12、24h測(cè)定，進(jìn)樣量為5μL，測(cè)得蒙古黃芪的黃芪苷RSD值為0.263%、0.265%，0.263%，0.266%，結(jié)果表明黃芪苷在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 加樣回收率 在加樣回收率實(shí)驗(yàn)中，我們?nèi)?fù)方黃芪顆粒粗提物2.00g，分別加入黃芪苷0mg、0.50mg、1.00mg，甲醇溶解過濾，母液上硅膠柱色譜，分選擇二氯甲烷甲醇10：1(200 mL)和4：1(400 mL)洗脫，然后繼續(xù)進(jìn)行微孔過濾，進(jìn)樣量為5μL。各個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取峰面積的平均值，結(jié)果見表1，表明其回收率高，穩(wěn)定性強(qiáng)。

表1 黃芪苷的加樣回收率

2.4 樣品含量 我們選擇復(fù)方黃芪顆粒的供試品溶液進(jìn)樣10μL測(cè)定黃芪苷的含量，結(jié)果顯示黃芪含量為3.39mg/5g。見表2。

表2 復(fù)方黃芪顆粒的黃芪苷含量

3 討 論 黃芪是豆科黃芪屬植物，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為黃芪性甘，微溫，歸肺，脾經(jīng)，具有斂瘡生肌、利尿托毒、補(bǔ)氣固表之功效[9]。在具體的藥學(xué)機(jī)制上，黃芪對(duì)正常機(jī)體的抗體生成功能有明顯促進(jìn)作用。黃芪作為常用的抗衰老中藥，可顯著提高老年大鼠的血漿皮質(zhì)醇含量[10]。黃芪合劑具有明顯的抗疲勞作用，能增強(qiáng)心肌收縮力，改善心臟功能。復(fù)方黃芪顆粒是當(dāng)前在臨床上應(yīng)用的一種常見藥物，該藥的功能主治為益氣、活血、熄風(fēng)、通絡(luò)。并且劑型攜帶、服用方便，當(dāng)前應(yīng)用有較高的抗乙肝病毒活性。現(xiàn)代研究表明研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方黃芪顆粒中含有的黃芪苷等化合物具有較強(qiáng)的生物活性，具有正性肌力作用及缺血性腦損傷保護(hù)作用及抗炎作用。

色譜法是近代發(fā)展起來的一種物理及物理化學(xué)的分離分析方法，其藥物化學(xué)成分分析的色譜方法包括薄層色譜、高效液相色譜、高速逆流色譜氣相色譜、超臨界流體色譜等。

本文采用高效液相色測(cè)定了復(fù)方黃芪顆粒中黃芪苷的含量，結(jié)果顯示色譜回歸曲線為Y=013.614X-1.4897，相關(guān)系數(shù)R=0.9979，線性范圍為10.2-102μg/ mL-1，表明線性回較好。同時(shí)分析結(jié)果表現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)方法精密度符合要求，黃芪苷在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，為復(fù)方黃芪顆粒中黃芪苷的含量評(píng)價(jià)提供了一定的依據(jù)。

當(dāng)前隨著分離提取、結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)的發(fā)展，復(fù)方黃芪顆粒已經(jīng)分離了多種三萜皂苷類化合物，顯示其化學(xué)成分復(fù)雜，對(duì)于有效物質(zhì)的提取與色譜分析要求更高[9]。我們?cè)谏V分析中，建立的體系為流動(dòng)相：甲醇-水-乙腈；流速：1mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：35℃。結(jié)果顯示其回收率高，穩(wěn)定性強(qiáng)，黃芪含量為3.39mg/5g。同時(shí)復(fù)方黃芪顆粒中生物活性成分多樣，單一活性成分的含量不能夠反應(yīng)黃芪的生物活性的全貌，還需要我們?cè)谙乱徊抗ぷ髦羞M(jìn)行多活性組分含量測(cè)定，使充分發(fā)揮其藥用價(jià)值，具有重要意義[11]。

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(收稿2014-08-16；修回2014-09-21)

黃芪苷/分析 色譜法，高壓液相 @復(fù)方黃芪顆粒

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A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.01.051