徐嘉蔚 陳 斌△ 李 玲 何 琬 王國(guó)棟 劉 璇

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 (湖南 長(zhǎng)沙，410007) 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院

肝硬化是臨床常見的慢性進(jìn)展性肝病，患者常伴有食欲減退、噯氣、早飽、腹脹、腹瀉或便秘等癥狀，然而這些癥狀與胃排空功能下降、小腸的移行性運(yùn)動(dòng)復(fù)合波(MMC)異常、胃腸激素紊亂等胃腸病理生理改變密切相關(guān)。在肝硬化模型大鼠中發(fā)現(xiàn)其胃腸運(yùn)動(dòng)減弱，排泄時(shí)間明顯延長(zhǎng)［1］，這不僅影響食物的消化吸收，而且消化道對(duì)細(xì)菌的順性機(jī)械排空作用也減弱，導(dǎo)致腸腔內(nèi)細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)繁殖，菌群失調(diào)，細(xì)菌移位，內(nèi)毒素產(chǎn)生增加［2］，加重肝微循環(huán)障礙、促進(jìn)肝纖維化［3］，形成對(duì)肝臟的“二次打擊”。本實(shí)驗(yàn)著重研究肝硬化模型大鼠血清胃動(dòng)素(MTL)、胃腸平滑肌細(xì)胞胃動(dòng)素受體(MTL-R)、門靜脈內(nèi)毒素水平的變化，并予“肝病實(shí)脾”法的代表方逍遙散及其拆方進(jìn)行干預(yù)，以探索“肝病實(shí)脾”的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar 大鼠70 只，雌雄各半，體重(120～140)g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK-(軍)2012-0004。

1.2 藥物和試劑 逍遙散由柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、生姜、薄荷、炙甘草組成，藥物均采用單味中藥配方顆粒(廣東一方制藥有限公司);牛血清白蛋白(北京Solarbio 公司，批號(hào):628C053);弗氏不完全佐劑(美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，批號(hào):1001646388);大豆胰蛋白酶抑制劑(sigma 公司，批號(hào):1001789621);Ⅱ型膠原酶(invitrogen 公司，批號(hào):17101015);顯色基質(zhì)鱟試劑盒(廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司，批號(hào):140325);大鼠MTL ELISA 試劑盒、大鼠MTLR ELISA 試劑盒(美國(guó)RD 公司，批號(hào):20140919)。

1.3 儀器 SK3003 半自動(dòng)生化分析儀(深圳市盛信康科技有限公司)，722s 可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);ELX800 酶標(biāo)儀(BioTek Instruments)，BX43 研究型正置顯微鏡(Olympus)，X1R 低溫高速離心機(jī)(Thermo Fisher);JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝技術(shù)公司);DZKW-4 型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.4 藥物配制 將牛血清白蛋白液與等容積弗氏不完全佐劑混合在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)上乳化，配成牛血清白蛋白乳化液。實(shí)驗(yàn)組用藥為逍遙散，由柴胡15g、當(dāng)歸15g、白芍15g、白術(shù)15g、茯苓15g、生姜6g、薄荷6g、炙甘草9g 組成，對(duì)照組為逍遙散去健脾藥物，由柴胡15g、當(dāng)歸15g、白芍15g、薄荷6g 組成。按照人與大鼠體表面積關(guān)系換算大鼠的生藥日用量，得出大鼠逍遙散日用量8.64g/kg，逍遙散去健脾藥物組日用量4.59g/kg，按照顆粒劑與生藥劑量換算關(guān)系，將生藥量換算成顆粒配方劑量，將所得逍遙散中藥顆粒劑劑量配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.155g/ml 溶液，逍遙散去健脾藥物為0.079g/ml 溶液，貯于4℃冰箱備用。

1.5 動(dòng)物造模方法 參照文獻(xiàn)方法［4］，用牛血清白蛋白致敏，模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組每次取0.5ml 牛血清白蛋白乳化液大鼠皮下多點(diǎn)注射，第1 次注射后間隔14d 進(jìn)行第2 次注射，之后每間隔10d 注射一次，共4 次。末次致敏后1 周，大鼠尾靜脈取血，瓊脂雙向擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢查牛血清白蛋白抗體，取陽(yáng)性抗體的大鼠進(jìn)行攻擊，每周兩次尾靜脈注射牛血清白蛋白，劑量每次0.4ml，牛血清白蛋白含量自2mg/次漸加0.5mg/次至4mg/次，維持此劑量，共15 次。正常組則給予等劑量生理鹽水尾靜脈注射，末次攻擊24h 后處死。

1.6 分組與給藥 將70 只Wistar 大鼠按雌雄各半，隨機(jī)分為正常組、模型組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組4 組。正常組10 只，其余各組20 只。各組于攻擊階段開始灌胃給藥，按10ml·kg-1·d-1的劑量給藥，每天灌胃1 次，直到動(dòng)物處死，用藥時(shí)間為兩個(gè)月，同時(shí)正常組、模型組給予等劑量生理鹽水。

1.7 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.7.1 血清肝功能指標(biāo)檢測(cè) 麻醉處死大鼠，抽取門靜脈血2ml，注入促凝管中，以SK3003 半自動(dòng)生化分析儀分別測(cè)定ALT、AST、TP、Alb。

1.7.2 內(nèi)毒素檢測(cè) 嚴(yán)格無(wú)菌狀態(tài)下，抽取門靜脈血lml 裝入無(wú)熱原抗凝管，3 000 rpm，離心2min，取上清液血漿標(biāo)本，行內(nèi)毒素檢測(cè)，具體方法參照顯色基質(zhì)鱟試劑盒說(shuō)明書。

1.7.3 血清MTL 濃度檢測(cè) 抽取右心房血2ml，注入促凝管中，3 000rpm，離心4min，取血清液，行酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)。

1.7.4 平滑肌細(xì)胞的制備 參照文獻(xiàn)方法［5］，將大鼠麻醉處死，無(wú)菌剖腹取胃，剪取胃竇(距幽門0.8-lcm)，沿胃小彎剪開，以冰冷的生理鹽水沖洗去食物殘?jiān)?，放入冰冷的Hepes-Ringer 緩沖液中，在無(wú)菌工作臺(tái)中，除掉大網(wǎng)膜，剝?nèi){膜，用止血鉗撕去粘膜，將新鮮的胃竇平滑肌0.5g 剪成2mm×2mm 小塊，將肌塊放入裝有4ml 消化液滅菌離心管中孵育，通以100%純O2，31℃水浴30min 后，離心(1 500r/min)4min。吸去消化液，在沉渣中再加消化液4ml，通以100%純O2，31℃水浴30min 后，上述離心條件下離心4min。吸去上清液，在沉渣中加Hepes-Ringer 緩沖液4ml，搖勻后，離心4min，洗滌3 次后，肌塊重浮于含10%牛血清白蛋白的Hepes-Ringer 液中，通入100%純O2，31℃水浴振蕩(30 次/min)25min。用40 目細(xì)胞篩網(wǎng)，將平滑肌細(xì)胞過(guò)濾，得到游離的單個(gè)平滑肌細(xì)胞，并收集于充滿100%純O2的30mL 的小錐形瓶中待用。在十二指腸與空腸交界處下1cm 處剪取4cm 長(zhǎng)的腸組織，剖開剝?nèi){膜與粘膜，洗凈，剪碎，裝入含10ml 消化液的滅菌離心管中，通入100%純O2，31℃水浴消化10 min，共2 次。消化完畢，1 800r/min 離心5min，棄上清液，加Hepes-Ringer 緩沖液洗滌2 次，棄上清液，再加入Hepes-Ringer 緩沖液10ml，通入氧氣，31℃，振蕩25min，而后用40 目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)篩，充氧氣。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)1 ×106/L，并用臺(tái)盼藍(lán)染液檢查細(xì)胞存活率(90%以上)。

1.7.5 平滑肌細(xì)胞胃動(dòng)素受體(MTL-R)檢測(cè) 取上述所得的胃腸平滑肌細(xì)胞懸液，行酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均采用±s 表示，多組間計(jì)數(shù)資料比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD 檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson(簡(jiǎn)相關(guān)分析)，P ＜0.05 為差異有顯著性意義，P ＜0.01 為差異有非常顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能結(jié)果 見表1。

表1 各組大鼠肝功能水平比較(±s)

表1 各組大鼠肝功能水平比較(±s)

與正常組比較，* P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01

2.2 各組大鼠門靜脈內(nèi)毒素、MTL、MTL-R 檢測(cè) 結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠門靜脈內(nèi)毒素水平，MTL、胃腸平滑肌細(xì)胞MTL-R 比較(±s)

表2 各組大鼠門靜脈內(nèi)毒素水平，MTL、胃腸平滑肌細(xì)胞MTL-R 比較(±s)

與正常組比較，* P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01;與對(duì)照組比較，★P ＜0.05

2.3 血清ALT、AST 與門靜脈內(nèi)毒素、血清MTL、胃腸平滑肌細(xì)胞MTL-R 的關(guān)系 血清ALT、AST 與門靜脈內(nèi)毒素具有正相關(guān)(r=0.391，0.334，P ＜0.05);與血清MTL 具有負(fù)相關(guān)(r=-0.535，P ＜0.01，r=-0.35，P ＜0.05);與胃竇平滑肌細(xì)胞MTL-R 具有負(fù)相關(guān)(r=-0.68，-0.451，P ＜0.01);與空腸平滑肌細(xì)胞MTL-R 呈負(fù)相關(guān)(r=-0.727，-0.503，P ＜0.01)。

2.4 血清TP、Alb 與血清MTL、胃腸平滑肌細(xì)胞MTL-R 的關(guān)系血清TP、Alb 與血清MTL 具有正相關(guān)(r=0.419，P ＜0.01，r=0.338，P ＜0.05);與胃竇平滑肌細(xì)胞MTL-R 具有正相關(guān)(r=0.403，0.468，P ＜0.01);與空腸平滑肌細(xì)胞MTL-R 具有正相關(guān)(r=0.482，P ＜0.01，r=0.328，P ＜0.05)。

3 討論

肝脾相關(guān)理論是中醫(yī)學(xué)五臟相關(guān)理論的重要組成部分。生理上肝脾相互為用、相互協(xié)調(diào)，而根據(jù)中醫(yī)五行生克關(guān)系，肝脾在病理上也是密切聯(lián)系，相互影響傳變。肝木氣有余，制己所勝，橫逆乘脾，而成“木旺乘土”;肝氣不及，則己所勝輕而侮之，而成“木虛土壅”;脾氣不及，肝氣雖然處于正常水平，然脾土不耐克伐，則“土虛木乘”。脾有實(shí)邪亦可反侮于肝，即為脾病傳肝。治療上張仲景在《金匱要略》里提出:“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”的治療原則。臨床上脾胃虛弱患者易發(fā)生惡心嘔吐、腹脹、腹瀉或便秘等癥狀，可見脾胃的納運(yùn)升降功能與胃腸動(dòng)力作用密切相關(guān)，而肝病患者常伴有胃腸功能障礙，脾虛因素貫徹始終［6］。故臨床在治療肝病時(shí)，常采用“肝病實(shí)脾”法，先實(shí)其脾氣，防止肝邪犯脾，導(dǎo)致疾病進(jìn)一步發(fā)展。

肝硬化患者胃動(dòng)素受體表達(dá)與胃排空時(shí)間具有相關(guān)性，胃竇黏膜胃動(dòng)素受體表達(dá)降低可能參與了肝硬化患者胃排空障礙［7］。失代償性肝硬化時(shí)小腸的移行性運(yùn)動(dòng)復(fù)合波(MMC)存在異常，且與Child-Pugh 分級(jí)相關(guān)［8］。肝臟受損時(shí)釋放大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，如前列腺素E2(PGE2)能引起胃腸運(yùn)動(dòng)紊亂，使胃腸移行性復(fù)合波(MMC)消失［9］。而胃動(dòng)素(MTL)是一種重要的調(diào)節(jié)胃腸消化功能的胃腸激素，可直接作用于平滑肌上的胃動(dòng)素受體，通過(guò)受體活化鈣通道，引起平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)游離鈣濃度升高［10］，導(dǎo)致平滑肌收縮加強(qiáng)，增加移行性復(fù)合運(yùn)動(dòng)(MMC)，促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)，可將空腹時(shí)吞下的唾液、胃黏液、上次進(jìn)食后遺留的殘?jiān)?、脫落的?xì)胞碎片和細(xì)菌等清除干凈，防止結(jié)腸內(nèi)的細(xì)菌在消化間期逆行入回腸，起“清道夫”的作用。而MMC 的改變及消失會(huì)引起腸道菌群失衡及上移，過(guò)度生長(zhǎng)的細(xì)菌產(chǎn)生各種毒素，引起各種并發(fā)癥，如肝性腦病、自發(fā)性腹膜炎、腸源性內(nèi)毒素血癥等，可加重肝臟的原發(fā)疾病，形成對(duì)肝臟的“二次打擊”［11］。

逍遙散始載于《太平惠民和劑局方》，既補(bǔ)肝體，又助肝用，氣血兼顧，肝脾并治，故為調(diào)和肝脾之名方。臨床上常用其加減治療肝纖維化，實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)逍遙散具有保肝護(hù)肝作用，減輕肝細(xì)胞變性、壞死，抑制炎細(xì)胞浸潤(rùn)，阻抑肝細(xì)胞的纖維化［12］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)其拆方，將原方組與去掉健脾藥物(白術(shù)、茯苓、生姜、炙甘草)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)逍遙散原方組對(duì)實(shí)驗(yàn)組肝硬化大鼠的ALT、AST 下降，TP、ALB 升高，減低門脈內(nèi)毒素水平，增加MTL，胃竇及空腸平滑肌細(xì)胞MTL-R 等方面具有優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明逍遙散具有保護(hù)肝硬化大鼠肝功能以及促進(jìn)胃腸動(dòng)力的作用。而對(duì)照組在ALT、AST、TP、門靜脈內(nèi)毒素水平、MTL、胃竇平滑肌細(xì)胞MTL-R 等方面和模型組無(wú)差異，說(shuō)明去掉健脾藥物則改善肝功能、促進(jìn)胃腸動(dòng)力及預(yù)防內(nèi)毒素血癥的作用明顯下降，逍遙散對(duì)肝臟的保護(hù)作用受影響。并且實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在增加胃竇平滑肌細(xì)胞MTL-R 方面有差異，說(shuō)明健脾藥物有增加胃竇平滑肌細(xì)胞MTL-R 的功能，可能為“肝病實(shí)脾”法的作用機(jī)制之一。通過(guò)ALT、AST、TP、ALB 與MTL、胃竇及空腸平滑肌細(xì)胞MTL-R相關(guān)性方面研究，顯示可以通過(guò)直接增加MTL、胃竇及空腸平滑肌細(xì)胞MTL-R，預(yù)防內(nèi)毒素血癥，而間接恢復(fù)肝功能;以及通過(guò)恢復(fù)肝功能，間接促進(jìn)胃腸動(dòng)力的作用。如李東垣所說(shuō)“脾胃之氣既傷，而元?dú)庖嗖荒艹?，而諸病之所由生也”。提出“內(nèi)傷脾胃，百病由生”，元?dú)馐墙】抵?，而脾胃是元?dú)庵?，因此注重扶養(yǎng)脾胃，借以護(hù)養(yǎng)元?dú)?，所謂“正氣存內(nèi)，邪不可干”。疏肝的同時(shí)加以健脾，“肝病實(shí)脾”法才能發(fā)揮綜合作用，對(duì)緩解病情、改善預(yù)后具有十分重要的意義。

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