劉子琦，肖朝江 ，張小東，徐 偉，彭俊霖，姜 北 *

（1.大理學(xué)院藥物研究所，云南大理 671000；2.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

瘧疾是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，全球每年發(fā)病人數(shù)達(dá)3～4 億，平均年死亡人數(shù)近百萬，其中絕大多數(shù)發(fā)生在非洲地區(qū)，5 歲以下兒童和孕婦是主要易感人群〔1〕。我國對瘧疾進(jìn)行了長期有效的防治，目前已基本控制了該疾病的大規(guī)模流行，但在云南、海南、安徽等地仍時(shí)有發(fā)生。由于境外多地尤其是與我國接壤的東南亞地區(qū)為瘧疾高發(fā)地區(qū)，防治工作不可掉以輕心，與瘧疾的斗爭仍十分艱巨〔2-3〕。歷史上，瘧疾的防治主要依靠奎寧等天然藥物，隨著導(dǎo)致瘧疾發(fā)生的瘧原蟲耐藥性的不斷積累，原有藥物療效日益下降。為此，近年來相繼研發(fā)出新一代抗瘧天然藥物青蒿素及相關(guān)產(chǎn)品，從一定程度上緩解了抗瘧藥物療效退化所帶來的壓力。然而，從長遠(yuǎn)發(fā)展的角度來看，隨著抗瘧藥物的不斷使用，瘧原蟲耐藥性必將逐漸產(chǎn)生，致使抗瘧藥物療效下降、進(jìn)而無法滿足抗瘧需要乃必然趨勢，因此新一代抗瘧藥物研發(fā)刻不容緩。本文以抑制β-羥高鐵血紅素形成實(shí)驗(yàn)的方式〔4-7〕，研究了10種采自云南西部地區(qū)的植物樣品抗瘧活性，為開發(fā)新一代抗瘧藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器COOL SAFE 95-15 冷凍干燥機(jī)（Gene Company Limited）；多功能酶標(biāo)儀（美國Bio Tek 儀器公司）；MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；AL204 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 主要試劑氯高鐵血紅素、氯喹二磷酸鹽、HEPES（美國Sigma 公司）；吡啶、冰醋酸（上海申博化工有限公司）；乙酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；二甲基亞砜（天津化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 植物樣品供試的10種植物樣品于2014年采自云南西部大理州境內(nèi)，由大理學(xué)院生藥學(xué)教研室張德全博士鑒定。

2 方法

2.1 植物粗提物的制備取約60 g植物干燥樣品，經(jīng)粉碎后分別用75%乙醇和水回流提取3 次，500 mL/次溶劑，分別將3次醇、水提取液合并，減壓濃縮除去大部分溶劑后冷凍干燥成粉末，即醇提取物、水提取物。按公式［凍干粉重量（g）/提取植物樣品干重（g）］×100% 計(jì)算提取率。

2.2 β-羥高鐵血紅素形成抑制試驗(yàn)精確稱取各植物樣品提取物凍干粉5 mg，溶解在1 mL 蒸餾水中，之后用蒸餾水按比例（1:4）稀釋成系列濃度溶液，作為供試品溶液備用。將50 μL 不同濃度的供試樣品加入96 孔板中，一式3 份，同時(shí)設(shè)置氯喹陽性對照和蒸餾水陰性對照。隨后每孔依次加入50 μL氯高鐵血紅素儲(chǔ)備液（1.0 mmol/L，溶解于DMSO中）和 80 μL 醋酸鹽緩沖液（4 mol/L，pH 5.0）與之混合。置于50 ℃培養(yǎng)箱中孵育5 h；取出置室溫后，每孔加入100 μL 30%（V/V）的吡啶-HEPES（20 mmol/L，pH 7.5）溶液使微孔板中固體混懸；室溫放置10 h后，從每孔中移取50 μL 上清液至另一96 孔板中，之后每孔加入200 μL 吡啶-HEPES（20 mmol/L，pH 7.5）溶液，并在405 nm波長處測定吸收值。由羥高鐵血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線得出未反應(yīng)的羥高鐵血紅素的濃度，從而計(jì)算出供試品對β-羥高鐵血紅素形成的抑制濃度（以IC50表示）〔6-8〕。

3 結(jié)果

3.1 10種植物的名稱及粗提率10種采自滇西地區(qū)的供試植物名稱及其醇、水提取物的提取率見表1。其中乙醇提取率為6.9%～33.4%，水提法提取率為1.8%～26.6%。

3.2 植物提取物β-羥高鐵血紅素形成抑制試驗(yàn)結(jié)果10 種植物提取物β-羥高鐵血紅素形成抑制試驗(yàn)結(jié)果見表2。梁王茶（地下）、球花報(bào)春花、西域蠟瓣花、糙毛杜鵑4種植物具有不同程度的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性（IC50＞1 388.9 μg/mL）。

4 討論

目前，治療瘧疾的藥物主要為氯喹、青蒿素類以及四環(huán)素增效劑〔9〕。氯喹能殺滅紅細(xì)胞內(nèi)期裂殖體，可迅速有效地控制由間日瘧原蟲和三日瘧原蟲以及敏感的惡性瘧原蟲引起的瘧疾，但現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲對氯喹產(chǎn)生抗藥性〔10-11〕。青蒿素是黃花蒿中提取的一種倍半萜內(nèi)酯過氧化物，作為治療惡性瘧最有效的藥物之一，被廣泛使用于全世界惡性瘧原蟲流行區(qū)，但隨著長時(shí)間的廣泛使用，其敏感性呈緩慢下降趨勢，所以研發(fā)全新的抗瘧疾藥物已十分緊迫〔12〕。

表1 供試植物名稱及提取率

表2 10種供試植物樣品的抗瘧活性（±s，n=3）

表2 10種供試植物樣品的抗瘧活性（±s，n=3）

植物名稱氯喹二磷酸鹽假煙葉樹梁王茶（地上）梁王茶（地下）球花報(bào)春花紫堇來江藤板凳果腋花杜鵑糙毛杜鵑蒼山滇白珠西域蠟瓣花粗提物—乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水不同濃度（μg/mL）樣品的β-羥高鐵血紅素形成抑制率/%1 388.9 106.6±15.9-6.6±3.3-8.5±3.8-2.8±1.2-1.4±5.3-4.0±1.5-4.8±0.6-8.2±1.5 28.7±6.0-1.8±0.7-9.3±1.9-13.7±1.3-12.7±2.5-15.0±0.7-6.4±1.5-3.1±1.2-3.9±2.5 0.2±2.0 3.3±1.9-3.0±3.2-3.6±1.3-4.4±0.9 7.1±2.4 277.8 98.9±17.1-9.9±1.0-10.4±0.8-1.6±4.2-0.5±3.7-3.5±0.3-2.8±3.0-8.0±0.7-1.5±6.1-8.3±1.7-16.5±1.3-14.9±0.6-10.1±3.3-16.6±0.7-3.4±1.2-2.8±1.9-6.4±0.3 3.4±2.4 1.5±1.7-5.4±1.3-4.2±2.7-9.2±0.1-5.8±0.6 55.6 88.0±13.4 1.0±1.5 4.8±3.3 10.4±0.5 8.8±1.9 4.3±4.3 4.3±1.1 3.5±2.1 2.5±2.3-2.9±4.0-10.1±0.7-12.4±0.7 6.1±3.5-5.9±3.4 3.8±1.1 11.6±5.1 4.2±3.2 12.1±2.8 10.0±3.1 3.6±6.4 8.8±3.1-1.5±2.1 9.8±7.3 11.1-2.2±3.8 9.8±6.1 9.0±1.8 12.7±2.5 9.2±2.9 4.0±2.0 16.5±1.5 8.2±6.6 11.0±3.1 11.0±0.5 3.1±1.2-2.1±4.6 1.8±3.5-0.8±4.7 3.9±0.7 13.5±1.6 9.3±1.7 12.8±4.8 17.1±0.1 3.4±3.4 8.8±5.4 9.2±3.4 12.2±4.5 2.2-3.0±4.6 7.5±2.4 8.5±6.2 7.6±1.8 3.5±4.1 7.1±5.7 7.7±3.4 18.4±1.7 7.5±4.0 10.1±2.4-2.1±0.4 11.6±5.6 1.5±1.7-1.2±3.4 10.1±0.6 12.2±2.8 10.1±0.0 12.1±4.7 13.7±2.9 9.4±2.5 9.6±2.1 10.4±3.2 10.7±2.6 IC50/(μg/mL)34.7±4.4——＞1 388.9＞1 388.9＞1 388.9——＞1 388.9— —＞1 388.9

β-羥高鐵血紅素形成抑制實(shí)驗(yàn)是一種間接測定藥物抗瘧活性的方法，具有操作簡便、快速、微量等高通量篩選實(shí)驗(yàn)的特性，有望成為體外篩選和評(píng)價(jià)抗瘧藥物強(qiáng)有力的手段〔4-7〕。本研究利用滇西地區(qū)豐富的植物資源以高通量篩選的方法尋找抗瘧活性植物樣品，為植物來源新型抗瘧藥物的研發(fā)提供了一種新的模式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明有4種植物具有不同程度的抗瘧活性，其中球花報(bào)春花的抗瘧活性最好，梁王茶地下部分、糙毛杜鵑和西域蠟瓣花水提取物的活性明顯好于醇提物；所選用的植物樣品涉及8個(gè)科9個(gè)屬，具有活性的植物樣品分布在4個(gè)科，說明具有抗瘧活性的植物種類較多、分布面廣，可以研究發(fā)掘的空間很大，這些工作為進(jìn)一步篩選抗瘧活性先導(dǎo)成分提供了基礎(chǔ)性依據(jù)。

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