王少嶺，杜 強(qiáng)，尹鮮思，金如意，王志龍

(湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點實驗室/湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128)

兩步法構(gòu)建灰飛虱RNAi載體及水稻遺傳轉(zhuǎn)化

王少嶺，杜 強(qiáng)，尹鮮思，金如意，王志龍*

(湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點實驗室/湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128)

灰飛虱不僅直接危害水稻，還是水稻條紋葉枯病和黑條矮縮病的傳播媒介。為了探索防治灰飛虱及由灰飛虱引起的水稻病毒病的方法，本研究利用兩步法快速高效構(gòu)建灰飛虱RNAi載體，并應(yīng)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化。針對灰飛虱的激活性蛋白激酶C受體(RACK)基因設(shè)計了一對特異性引物，通過PCR擴(kuò)增一段200 bp的干擾片段，將干擾片段克隆到入門載體pENTR，再經(jīng)過LR反應(yīng)使入門載體上的干擾片段整合入目的載體pANDA，形成RNAi載體pANDA-RACK，通過農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入武陵粳1號，獲得20株經(jīng)鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因植株，為防控灰飛虱及其傳播的水稻病毒病提供了珍貴材料。

水稻；灰飛虱；RNAi載體構(gòu)建；轉(zhuǎn)基因

灰飛虱(Laodephaxstriatellus)屬同翅目、飛虱科昆蟲，是亞洲糧食種植區(qū)的重要害蟲之一[1]。在我國各地均有分布，主要以長江流域和華北地區(qū)發(fā)生較多[2，3]，不僅通過刺吸植物枝葉導(dǎo)致植株枯黃萎死，同時也是水稻條紋葉枯病[4]、水稻黑條矮縮病及玉米粗縮病[5]的主要傳播媒介。據(jù)統(tǒng)計，我國已有17個省市水稻種植區(qū)遭受水稻條紋葉枯病影響[6]，長江流域中東部作物種植區(qū)均受到水稻黑條矮縮病侵襲[7]，玉米粗縮病也已覆蓋13個省[8]，嚴(yán)重影響糧食作物產(chǎn)量和品質(zhì)。另外，由于灰飛虱的寄主廣泛，遷徙特性及近年來的環(huán)境漸暖，越來越有利于灰飛虱越冬和大量繁殖，灰飛虱數(shù)量呈上升趨勢，同時以灰飛虱為傳播媒介的水稻病毒病呈大范圍爆發(fā)趨勢，對我國糧食安全造成巨大威脅。目前針對灰飛虱及以灰飛虱為傳播媒介的水稻病毒病的主要防治措施還是使用化學(xué)藥劑，這種方法不僅污染環(huán)境，而且導(dǎo)致灰飛虱種群抗藥性增強(qiáng)[9]，防治效果不理想。因此，如何控制并降低灰飛虱危害已是農(nóng)業(yè)工作者面臨的重大挑戰(zhàn)。利用分子生物學(xué)技術(shù)并結(jié)合傳統(tǒng)的遺傳育種手段，挖掘培育高抗灰飛虱的水稻新品種，是防治灰飛虱及以灰飛虱為傳播媒介的水稻病毒病的經(jīng)濟(jì)、有效措施，也是控制灰飛虱種群的重要途徑[10]。

RNA干擾(RNAi)是通過堿基配對特異性結(jié)合靶標(biāo)基因mRNA，從而將其降解達(dá)到沉默靶標(biāo)基因，干擾特定生命過程的有效技術(shù)[11，12]。隨著RNAi技術(shù)的成熟，RNAi技術(shù)在動植物基因功能研究中得到廣泛應(yīng)用[13]。因其高效特異性，RNAi技術(shù)在植物病毒病方面也得到應(yīng)用[14]。Waterhouse等利用RNAi技術(shù)成功提高了馬鈴薯對馬鈴薯Y病毒的抗性[15]，表明RNAi技術(shù)在提高植物抗病毒能力方面切實可行。同時，也有研究者提出通過RNAi沉默害蟲體內(nèi)的重要基因從而影響害蟲的生長發(fā)育達(dá)到防治害蟲的新策略。激活性蛋白激酶C受體RACK屬于WD蛋白家族成員，可以與蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)結(jié)合，在調(diào)控細(xì)胞表面受體和細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用[16]。Li等[17]將該基因從灰飛虱中克隆出來，猜測該蛋白可能參與病毒粒子與灰飛虱宿主的互作。Zha等[18]通過RNA blot分析發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因水稻的葉片和韌皮汁液中可檢測到dsRNA，并且一些dsRNA被切割成siRNA；將轉(zhuǎn)基因植株喂食褐飛虱2 d和4 d，發(fā)現(xiàn)褐飛虱體內(nèi)同源基因表達(dá)量明顯下降，實驗表明通過轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)的dsRNA可以引起褐飛虱RNA干擾效應(yīng)。Yu等[19]也發(fā)現(xiàn)，喂食褐飛虱轉(zhuǎn)基因水稻可引起褐飛虱基因表達(dá)量下調(diào)。本研究針對灰飛虱激活性蛋白激酶C受體基因，利用兩步法快速高效構(gòu)建RNAi載體，導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化法獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株，以為下一步鑒定對灰飛虱及以灰飛虱為傳播媒介的水稻病毒病抗性研究提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

灰飛虱由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因工程實驗室培養(yǎng)繁殖。水稻轉(zhuǎn)化受體材料武陵粳1號，來自揚(yáng)州大學(xué)，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因工程實驗室繁種保存。

1.2 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α購自北京全式金公司；農(nóng)桿菌EHA105由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因工程實驗室保存；pENTR載體和pANDA載體由北京植物保護(hù)研究所惠贈。

1.3 方法

(1)灰飛虱激活性蛋白激酶C受體(Receptor for activated protein kinase C，RACK)基因的下載、RNAi引物設(shè)計及入門載體的構(gòu)建。根據(jù)灰飛虱RACK基因的Genebank序列號(HQ385972.1)，利用NCBI網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)查找基因序列并下載整個CDS。根據(jù)普通引物設(shè)計原則及RNAi引物設(shè)計注意事項設(shè)計合適引物，配合使用常用引物設(shè)計軟件Primer primer5.0與在線引物設(shè)計網(wǎng)站NCBI上的primer blast(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index. cgi LINK_LOC=BlastHome)，根據(jù)載體pENTR的特點及下游重組反應(yīng)，在引物5′端分別加上BamHI、XhoI酶切位點及保護(hù)堿基，設(shè)計了一對特異引物RACK-270-F(5′-CG GGATCC GGATCTTGCTGCCGGTCGTA-3′)及RACK-470-R(5′-CCCTCGAGTTGGATTGGCGTGGTTGG-3′)，其擴(kuò)增產(chǎn)物大小為200 bp。以灰飛虱為材料，采用Trizol法提取灰飛虱總RNA，根據(jù)Thermo公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以灰飛虱cDNA為模板，RACK-F/R引物擴(kuò)增RNAi片段，使用TAKARA公司rTaq進(jìn)行擴(kuò)增，退火溫度為56℃，28個循環(huán)；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用北京全式金公司膠回收試劑盒回收目的片段，將回收產(chǎn)物和pENTR入門載體用NEB公司BamHI、XhoI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，利用試劑盒回收載體和目的片段；采用Thermo公司的T4連接酶將片段和載體進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建pENTR-RACK載體，通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，挑選單克隆進(jìn)行酶切驗證，將經(jīng)過驗證的陽性克隆送上海生工公司測序證實。

(2) LR重組反應(yīng)。使用Invitrogen公司LR Clonase Mix進(jìn)行LR反應(yīng)。將驗證好的pENTR-RACK入門載體與目的載體pANDA按照一定的比例混合。每10 μL反應(yīng)體系中，入門載體的用量在100～150 ng范圍內(nèi)，pANDA用量為150 ng，加入2 μL的LR Clonase Mix，加1×TE buffer至10 μL，25℃過夜反應(yīng)，冰上加入1 μL Proteinase K，37℃孵育10 min，將LR反應(yīng)液加入50 μL大腸桿菌感受態(tài)熱激轉(zhuǎn)化，涂Kan/Hyg雙抗平板，37℃培養(yǎng)20 h，挑選單克隆酶切驗證。

(3)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化。通過電擊法將構(gòu)建好的RNAi載體pANDA-RACK轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR驗證和雙酶切驗證。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻黑條矮縮病高感品種武陵粳1號，采用潮霉素篩選法，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

(4)轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定。將得到的轉(zhuǎn)基因T1代植株從生根培養(yǎng)基上取出，用自來水洗凈根部培養(yǎng)基，移植到大田，待苗子健壯后，剪取少許葉片放于含有潮霉素水(H2O∶Hyg=1 000∶1)的管子中浸泡5～7 d，選取葉片仍為綠色的植株，提取葉片基因組DNA，使用目的引物RACK-270-F、RACK-470-R進(jìn)行轉(zhuǎn)基因PCR陽性鑒定。再從已鑒定為陽性的植株中選取幾株進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)量分析，確定插入片段的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 入門載體的構(gòu)建及分析

以灰飛虱cDNA為模板，rTaq酶擴(kuò)增出大小約200 bp的目的條帶(圖1)，最佳退火溫度56℃，28個循環(huán)，將得到的條帶切膠回收，再進(jìn)行酶切，連接到pENTR載體上，熱激轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，挑取陽性克隆進(jìn)行酶切驗證(圖2)，連接正確的質(zhì)粒上將會切出一條200 bp的條帶。將酶切正確的樣品送公司測序，測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站Blast比對，比對結(jié)果同源性100%，表明克隆結(jié)果正確，可用于下一步的LR重組。

圖1 RACK基因RNAi片段克隆Fig.1 Cloning of RNAi fragment from RACK gene注：1，2.PCR產(chǎn)物；M.2 kb Maker。

圖2 pENTR-RACK載體酶切驗證Fig.2 Identification of pENTR-RACK vector by restriction enzyme digestion注：1，2.pENTR-RACK載體BamHI、XhoI雙酶切；M.2 kb Maker。

2.2 LR重組反應(yīng)

將測序正確的pENTR-RACK入門載體與目的載體pANDA使用Invitrogen公司的LR酶嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行LR反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，涂于Kan/Hyg雙抗平板，37℃培養(yǎng)20 h左右，挑單菌落搖菌提取質(zhì)粒，KpnI/SacI雙酶切驗證，pANDA空質(zhì)粒雙酶切后得到4.4 kb的條帶，重組陽性質(zhì)粒是1.7 kb左右。圖3顯示得到正確的RNAi載體pANDA-RACK。

圖3 重組質(zhì)粒的酶切驗證Fig.3 Identification of pANDA-RACK vector by restriction enzyme digestion注：M.Generuler 1 kb；pANDA：pANDA空質(zhì)粒KpnI、SacI雙酶切；pANDA-RACK：重組RNAi載體KpnI、SacI雙酶切。

2.3 轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及驗證

將重組正確的pANDA-RACKRNAi載體通過電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，驗證正確后，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因植株26株。

采用潮霉素浸泡法進(jìn)行初步篩選，陽性植株應(yīng)具有潮霉素抗性，葉片表現(xiàn)為綠色。如圖4(封三，下)，CK-為轉(zhuǎn)化受體材料武陵粳1號，CK+為已經(jīng)確定的轉(zhuǎn)基因植株，1～26為轉(zhuǎn)基因材料，除3，7，8，12外，其余22株均與陽性對照一樣表現(xiàn)綠色，初步鑒定為陽性植株。用CTAB法提取受體材料武陵粳1號和經(jīng)潮霉素初篩后表現(xiàn)為陽性的植株葉片基因組DNA，使用目的片段引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定片段的插入情況，電泳結(jié)果如圖5。從圖5可見，CK-為武陵粳1號陰性對照，沒有PCR產(chǎn)物出現(xiàn)，CK+為含有目的條帶的陽性質(zhì)粒對照，后面為經(jīng)潮霉素初篩后成活的轉(zhuǎn)基因植株，其目的片段與陽性對照大小一致，確定這20株植株中插入了目的基因片段。從中選取幾株進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)量分析，如圖6。從圖6可見，以武陵粳1號為對照組，灰飛虱RACK基因與水稻基因組無同源性，相對對照組表達(dá)量上調(diào)，幾株轉(zhuǎn)基因材料RACK基因相對表達(dá)量均有一定程度的上調(diào)，其中RACK-1上調(diào)67倍，RACK-10上調(diào)25倍，RACK-16上調(diào)11倍，進(jìn)一步表明灰飛虱外源片段導(dǎo)入了水稻中，并且可以在水稻中轉(zhuǎn)錄，為轉(zhuǎn)基因陽性植株。

圖5 轉(zhuǎn)基因陽性植株P(guān)CR檢測
Fig.5 PCR identification of transgenic plants
注：CK-.轉(zhuǎn)基因受體材料武陵粳1號，陰性對照；CK+.含有RNAi片段的重組質(zhì)粒，陽性對照；1～25：轉(zhuǎn)基因陽性植株。

圖6 轉(zhuǎn)基因陽性植株qRT-PCR檢測結(jié)果Fig.6 qRT-PCR identification of transgenic plants

3 結(jié)論與討論

近年來，由于氣候、環(huán)境、栽培方式等因素的影響，灰飛虱繁殖速度加快，種群變大，對作物造成嚴(yán)重危害，同時以灰飛虱為傳播媒介的水稻黑條矮縮病和水稻條紋葉枯病在我國及一些東亞國家大范圍肆行，對糧食安全構(gòu)成很大威脅。目前采用的防治措施主要是使用化學(xué)殺蟲劑，然而隨著灰飛虱抗藥性增強(qiáng)，防治效果越來越差，利用分子技術(shù)手段選育抗蟲新品種勢在必行。

RNAi技術(shù)的高效特異性在分子抗病毒育種中已得到廣泛應(yīng)用。2004年，馬中良等構(gòu)建了水稻矮縮病毒的RNAi載體，發(fā)現(xiàn)對該病毒有很高抗性[20]。2011年，姜明松等利用RNAi沉默RSV病毒成功獲得高抗RSV的水稻株系[21]。Shimizu Takumi等通過RNAi技術(shù)沉默RBSDV的非結(jié)構(gòu)蛋白基因Segment9也獲得很好的抗病效果[22]。

目前，國內(nèi)外對水稻病毒病的研究主要著眼于病毒本身，很少涉及傳播媒介灰飛虱[23，24]。然而病毒種類繁多，研究多是針對單一病毒，范圍較窄，若通過培育高抗灰飛虱的水稻品種，不僅可以防治灰飛虱本身對水稻造成的危害，也可積極預(yù)防由灰飛虱引起的水稻病毒病。也有人提出通過干擾害蟲本身的重要基因，從而得到高抗害蟲的作物品種[25]。張倩等通過干擾灰飛虱的海藻糖酶基因發(fā)現(xiàn)可顯著抑制它的生長，增加死亡率[12]，證明RNAi技術(shù)特異沉默昆蟲關(guān)鍵基因是一個可行的措施。本研究通過兩步法高效快速的成功構(gòu)建了針對灰飛虱RACK基因的RNAi載體，并獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株。對水稻轉(zhuǎn)基因陽性的鑒定采用層層遞進(jìn)方法，首先利用潮霉素初步篩選抗性植株，排除假陽性，降低了后續(xù)工作量。將經(jīng)過潮霉素初篩的植株通過PCR方法確定目的片段的插入情況，發(fā)現(xiàn)潮霉素浸泡法可以有效排除假陽性，PCR鑒定陽性結(jié)果為100%。再根據(jù)PCR結(jié)果進(jìn)行qRT-PCR，分析插入片段的轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)RACK-1，RACK-10，RACK-16的相對表達(dá)水平較高，可以用作下一步實驗的研究材料，為下一步進(jìn)行的以灰飛虱為傳播媒介的水稻病毒病的抗性研究奠定了一定基礎(chǔ)，也為RNAi技術(shù)在昆蟲方面的應(yīng)用提供了實踐支持。

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Construction of RNA Interference Vector ofLaodephaxstriatelluswith A Two-step Method and Its Transformation in Rice

WANG Shao-ling，DU Qiang，YIN Xian-si，JIN Ru-yi，WANG Zhi-long*

(Hunan Provincial Key Laboratory for Crop Germplasm Innovation and Resource Utilization/College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China)

Laodephaxstriatelluscould not only damage rice directly，but also works as media to spread Rice Stripe Disease and Rice Black Streaked Dwarf Disease.To explore techniques for controllingLaodephaxstriatellusand rice virus diseases caused by it，RNAi vector was efficiently and rapidly constructed by a two-step method.One pair specific primer was designed forRACKgene fromLaodephaxstriatellusto amplify 200 bp interference fragment，and then cloned it into entry vector pENTR.Then the RNAi fragment was recombined into destination vector pANDA through LR reaction to form RNAi vector pANDA-RACK，which was transformed into rice cultivar Wulingjing No.1 mediated byAgrobacteriumtumefaciensEHA105.Twenty transgenic plants were generated and identified by PCR，which plays a foundation againstLaodephaxstriatellusand its transmitted virus diseases in rice.

rice；Laodephaxstriatellus；RNAi；transgene

2015-02-14

王少嶺(1988-)，女，河北石家莊人，碩士研究生，Email：wanglingerqq@126.com。

*通信作者：王志龍，Email：zhilongwang@126.com。

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項 (2012ZX08009001)；教育部“創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃”項目(IRT1239)；湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊項目(2012)。

S511.03；Q78

A

1001-5280(2015)03-0230-05

10.3969/j.issn.1001-5280.2015.03.03