趙 璐，胡日生，蔡長春，周真珍，劉 志，賀利雄*

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128； 2 湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030； 3 湖南省煙草公司，長沙 410004)

秋水仙素對煙草單倍體植株染色體加倍的影響

趙 璐1，胡日生2，蔡長春3，周真珍1，劉 志1，賀利雄1*

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128； 2 湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030； 3 湖南省煙草公司，長沙 410004)

為了提高煙草單倍體技術(shù)中的染色體加倍率，以K394×云煙87的F1代花藥組培單倍體煙苗為供試材料，研究了不同濃度秋水仙素處理對煙草單倍體苗的成苗率、大田移栽成活率和染色體加倍率的影響；以浸苗法為對照，在植物無根的情況下，研究了秋水仙素對煙草單倍體苗的成苗率、大田移栽成活率和染色體加倍率的影響。結(jié)果表明：秋水仙素濃度降低，成苗率和大田移栽成活率會(huì)升高而染色體加倍率會(huì)降低；無根系煙苗在加倍時(shí)染色體加倍率普遍比有根的煙苗低。

煙草；單倍體；染色體加倍；秋水仙素

DH群體即單倍體植株經(jīng)過自然或者人工染色體加倍就可以得到基因位點(diǎn)純合的加倍單倍體系，具有群體內(nèi)基因純合，群體間存在著遺傳多樣性，是不分離群體[1]的優(yōu)點(diǎn)。隨著單倍體育種技術(shù)的發(fā)展，許多植物的DH群體被成功構(gòu)建。如朱惠琴等[2]構(gòu)建了G28×NC2326和K326×Coker176的DH群體；劉仁祥等[3]構(gòu)建了(K326×中煙90)×(Corker176×紅大)的DH群體；陳學(xué)軍等[4]構(gòu)建了紅大、Hicks、紅大×K326、紅大×白肋21、紅大×巴斯瑪、白肋21×TN86和巴斯瑪×沙姆遜的DH群體。煙草DH群體的構(gòu)建，秋水仙素加倍主要運(yùn)用的是浸苗法，即將整株組培苗放入秋水仙素中加倍，一般加倍的濃度為0.4%～0.2%，時(shí)間一般為24～72 h。許多學(xué)者在探索煙草DH群體構(gòu)建中，也嘗試過別的方法加倍，如浸花藥法、浸花培苗法、葉片再生法及浸腋芽法，但尚未見有人運(yùn)用浸根法[5]來加倍煙草。煙草花藥培養(yǎng)技術(shù)已非常成熟，但與其他植物相比較，如小麥[6]、草莓[7]等，煙草的染色體加倍率較低，獲得大量DH群體的技術(shù)有待加強(qiáng)。因此以不同類型煙草雜交組合后代為材料進(jìn)行加倍時(shí)，需要考慮多方面的影響因素。

筆者在前人實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以K394×云煙87的F1代煙苗為材料，對其加倍方法進(jìn)行研究，探討不同濃度秋水仙素對煙苗單倍體成苗率和加倍率的影響，并研究植物有無根系時(shí)，對煙草組培苗加倍的影響，以為煙苗染色體加倍提供新的啟發(fā)，為煙草誘變育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以K394×云煙87組合的F1代花藥組培單倍體煙苗作為試驗(yàn)材料。

2013年下半年，將湖南中煙公司提供的K394×云煙87組合的F1材料，種植在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)中國煙草中南農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站試驗(yàn)田。在其盛花期的單核靠邊期采集花蕾(花冠剛露出花萼或兩者平齊)，進(jìn)行花藥培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 染色體加倍方法

選取適當(dāng)大小(莖長2.5～3.5 cm)的單倍體組培煙苗，對于較長煙苗(莖部長于2.5～3.5 cm)，從頂端至下截取2.5～3.5 cm的莖部。共同的方法是：莖上多余的葉片剪去，只留兩片頂葉。頂葉的長度保持在1.5～2.0 cm之內(nèi)。滅菌后的150 mL三角瓶中分別倒入35 mL不同濃度的秋水仙素，分別放入有根的組培苗與無根的組培苗(即從培養(yǎng)基中取出后剪去根系，保留莖部和葉部)，并使保留的兩片頂葉漂浮在秋水仙素溶液上。

1.2.2 秋水仙素濃度的選取

用不同濃度梯度的秋水仙素進(jìn)行加倍處理。設(shè)定秋水仙素濃度為4 000(0.4%)、2 000、1 500、1 250、1 000、750、500、250、75 mg/L(0.0075%)，并對其成苗率、大田移栽成活率和染色體加倍率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 有根和無根煙苗加倍

在上述750和75 mg/L的秋水仙素濃度中，又分別將煙苗分為帶根系的植株和切除根系的植株，標(biāo)記為有根和無根，并對其成苗率、大田移栽成活率和染色體加倍率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 倍性鑒定

1.3.1 葉片氣孔大小、數(shù)目以及保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法

待組培苗長至8～13片真葉時(shí)，剪下植株頂端向下第5片真葉。用透明膠帶粘取葉片下表皮[8]，撕其下表皮置于載玻片上，滴1滴碘-碘化鉀(1∶3)溶液，在40×的物鏡，10×的目鏡下對保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的葉綠體計(jì)數(shù)，每片葉隨機(jī)選取8個(gè)氣孔，觀察葉綠體數(shù)目并計(jì)算平均數(shù)[9]。撕取下表皮，在40×的物鏡，10×的目鏡區(qū)域?qū)饪准?xì)胞的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每片葉隨機(jī)選取8片區(qū)域。撕取下表皮，在100×的物鏡，10×的目鏡下對氣孔的長寬進(jìn)行測量，每片葉隨機(jī)選取8個(gè)氣孔[10]。

1.3.2 流式細(xì)胞儀鑒定法

取秋水仙素處理兩周后并生長到同一時(shí)期的煙葉，用流式細(xì)胞儀鑒定(Quanta SC)其倍性，具體使用方法參考EPICSRXLTM Cytometers中文應(yīng)用培訓(xùn)手冊(美國貝克曼庫爾特有限公司)。緩沖液的配制參考文獻(xiàn)[11]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

煙草花藥再生苗的成苗率、大田移栽成活率及染色體加倍率的計(jì)算公式：

成苗率=(加倍處理后成活苗數(shù)/加倍處理前的苗數(shù))×100%；

大田移栽成活率=(大田移栽后成活苗數(shù)/加倍處理后成活苗數(shù))×100%；

染色體加倍率=(染色體加倍的植株數(shù)/大田移栽后成活苗數(shù))×100%；

綜合染色體加倍率=(染色體加倍的植株數(shù)/加倍處理前的苗數(shù))×100%。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 流式細(xì)胞儀檢測煙苗染色體加倍情況

以花藥培養(yǎng)得到的單倍體植株和以K394×云煙87組合(二倍體)的煙葉作為標(biāo)尺，確定單倍體的峰值出現(xiàn)在100道的位置，二倍體的峰值出現(xiàn)在200道的位置。在檢測條件不變的情況下，成功加倍的雙單倍體峰值在200道出現(xiàn)；未加倍成功的煙草在100道上有峰值(圖1)。結(jié)果顯示，試驗(yàn)的2 218株植株中成功加倍的有29株DH植株，其中有28株為雙單倍體，1株為二/四倍體嵌合體，無四倍體的情況。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測煙苗染色體加倍效果

2.2 葉片氣孔大小、數(shù)目以及保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)結(jié)果

從表1看出，單倍體植株氣孔的長和寬平均值為57.75和50.67 μm，二倍體植株氣孔的長和寬平均值為63.92和57.90 μm，較單倍體植株大6.17和7.23 μm；雙單倍體植株氣孔的長和寬平均值為62.95和56.59 μm，較單倍體植株大5.20和5.92 μm。不同倍性煙葉的氣孔長度和寬度有一定的差異，二倍體和雙單倍體在長寬度上差異不大(圖2)。在10×40的顯微鏡下，單倍體、二倍體和雙單倍體區(qū)域氣孔數(shù)目平均值為66、56和54個(gè)。

圖2 不同倍性植株在10×100倍顯微鏡下的氣孔大小

根據(jù)劉仁祥等[12]和賈興華等[13]的試驗(yàn)，煙草單倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體為0～15個(gè)，煙草二倍體葉綠體為15～25個(gè)，多倍體為25以上。對試驗(yàn)中經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測顯示成功加倍的雙單倍體煙草葉片以及未加倍成功的煙草葉片進(jìn)行氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體的觀察，統(tǒng)計(jì)顯示單倍體、雙單倍體以及二/四倍體嵌合體煙葉的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體分別為7～17、10～28以及24～30個(gè)，平均數(shù)分別為11、18和26個(gè)，單倍體與雙單倍體、雙單倍體與二/四倍體嵌合體的比值為0.61和0.69，兩個(gè)比值都接近1∶2，且差異顯著(p<0.05)。顯微鏡觀察結(jié)果如圖3所示。

圖3 葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法結(jié)果

倍性煙葉氣孔長度氣孔寬度平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(μm)最大值(μm)最小值(μm)變異系數(shù)(%)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(μm)最大值(μm)最小值(μm)變異系數(shù)(%)單倍體5775±7707081450613335067±572567539561128二倍體6392±7417694522511595790±55867254950965雙單倍體6295±627701951509965659±644665646691139

2.3 不同濃度秋水仙素處理煙苗的結(jié)果

用本試驗(yàn)方法對煙苗進(jìn)行加倍，發(fā)現(xiàn)濃度為1 250、1 500、2 000、4 000 mg/L的秋水仙素由于毒害作用，處理的單倍體煙苗48 h后全部死亡。1 000 mg/L的秋水仙素濃度加倍處理48 h后有5株植株存活，移栽入大田中后也全部死亡。

750 mg/L以下(包含750 mg/L)濃度的秋水仙素處理48 h后，成苗率和大田移栽成活率隨著濃度的降低而升高，成苗率從79.98%上升到82.54%，大田移栽成活率從82.15%上升到89.86%。染色體加倍率和綜合染色體加倍率在750和500 mg/L有一個(gè)小高峰后開始降低，從1.62%下降到0.87%。從加倍效率來說，最佳的秋水仙素濃度為750 mg/L(表2)。

表2 不同濃度秋水仙素處理煙苗結(jié)果

2.4 有根與無根煙苗秋水仙素處理結(jié)果

在總體趨勢上，有根的煙苗比無根的染色體加倍率高；在成苗率上，秋水仙素濃度為750 mg/L時(shí)，無根的處理比有根的處理高，而在濃度為75 mg/L時(shí)，有根與無根處理的成苗率相似；在大田移栽成活率上，750和75 mg/L的處理，都是無根比有根高(表3)。

表3 有根與無根處理煙苗結(jié)果

3 討論

3.1 關(guān)于綜合加倍率

采用低濃度的秋水仙素處理時(shí)可以獲得較高的成苗率，但亦會(huì)導(dǎo)致較低的染色體加倍率，因此有必要對秋水仙素的濃度選擇進(jìn)行綜合考慮。本試驗(yàn)采用最大濃度750 mg/L的秋水仙素進(jìn)行處理，其綜合加倍率為1.62%；最小濃度75 mg/L的秋水仙素處理，其綜合加倍率為0.87%。陳學(xué)軍等人采用的高濃度秋水仙素進(jìn)行處理，其綜合加倍率在1.52%到2.76%之間[4]。本試驗(yàn)采用750 mg/L的濃度秋水仙素加倍的一次加倍效果與其相當(dāng)。

3.2 關(guān)于葉片氣孔大小、數(shù)目以及保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)結(jié)果

國內(nèi)許多學(xué)者都證實(shí)過同一倍性的煙葉植株上的不同葉片間及同一葉片的不同部位間，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)的平均值非常接近，在用葉綠體計(jì)數(shù)法鑒定倍性時(shí)，可以不受葉片發(fā)育時(shí)期與部位的影響[14]，類似情況的還有蘋果和梨[15]、辣椒[16]等。

關(guān)于葉片氣孔大小及單位面積內(nèi)的數(shù)目，在西葫蘆[17]、葡萄[18]等作物上有報(bào)道，作物的倍性越高，氣孔越大，而單位面積內(nèi)的氣孔越少，其中的差異很顯著，可以作為鑒定植物倍性的標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)中，煙草單倍體與二倍體之間氣孔大小和葉片單位面積內(nèi)氣孔數(shù)目是有一定的差異，但差異并不顯著，且變幅較大，需要經(jīng)過大量統(tǒng)計(jì)才能得出其中的差異性。因此，對于單株煙草的倍性鑒定，并不推薦用葉片氣孔大小及單位面積內(nèi)氣孔數(shù)目進(jìn)行鑒定，具有類似情況的還有甘藍(lán)類蔬菜[19]、黃瓜[20]、大白菜[21]。

3.3 關(guān)于煙草成苗率

從表2、3可以看出，秋水仙素濃度的增高會(huì)導(dǎo)致成苗率降低。普遍煙草單倍體加倍方法[2，6]一般采用4、2 g/L秋水仙素進(jìn)行處理，其成苗率在30%左右，而本試驗(yàn)方法的成苗率高達(dá)80%左右。如果在此基礎(chǔ)上進(jìn)行反復(fù)加倍，可節(jié)約煙苗材料。同時(shí)本試驗(yàn)降低了秋水仙素的使用量，節(jié)約了試驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，減少了對環(huán)境的污染。

3.4 秋水仙素對無根植物加倍的影響

從表3可以看出，秋水仙素處理后，有根處理的染色體加倍率普遍比無根處理的高。筆者認(rèn)為有根處理染色體加倍率高的原因：無根的煙草組培苗因?yàn)闆]有根系輔助吸收秋水仙素，導(dǎo)致秋水仙素作用于植株內(nèi)有絲分裂的細(xì)胞幾率減小，從而導(dǎo)致加倍率降低。

4 問題與展望

(1)對于很多植物來說，不同器官均可以誘導(dǎo)出多倍體，如百合的鱗片、試管苗、不定芽、叢生芽、愈傷組織、葉柄等[22]。不同器官的誘導(dǎo)率不同，對秋水仙素毒害作用的敏感程度也不同。在用植物器官誘導(dǎo)多倍體時(shí)，秋水仙素是否對于植物傷口也有一定的毒害作用，國內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道。

(2)在用秋水仙素加倍時(shí)，對于不同的材料、不同的生長時(shí)期，一定要多方面考慮影響加倍效率的因素，如時(shí)間、溫度、濃度等，也可以使用多種方法對煙苗進(jìn)行加倍。此方面的工作有待深入，還需找出更多更好的方法讓煙草DH群體的構(gòu)建效率更高。

致謝：朱咸鑫、曾繁飛、陳曉煥等參與了實(shí)驗(yàn)，一并致謝！

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Influence of Colchicines on Chromosome Doubling of Tobacco Haploid

ZHAO Lu1，HU Ri-sheng2，CAI Chang-chun3，ZHOU Zhen-zhen1，LIU Zhi1，HE Li-xiong1*

(1 College of Bio-science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China2 Tobacco Research Institute of Hubei Province, Wuhan, Hubei 430030, China;3 Hunan Province Tobacco Company, Changsha, Hunan 410004, China)

To increase the chromosome doubling rate during tobacco haploid technique，the effects of different concentrations of colchicines on the seedling rate of haploid tobacco seedlings，surviving rate of cropland transplanting and the chromosome doubling rate were studied with haploid Tobacco seedling，produced from anthers tissue culture method via the K394×Yunyan87’s F1generations of tobacco，as the experimental materials.Taking the soaking seedling method as comparison，under the condition of rootless tobacco plants，the influence of colchicines on the seedling rate of haploid tobacco seedlings，the surviving rate of cropland transplanting and the chromosome doubling rate were studied.The results indicated that the seedling rate of haploid tobacco seedlings and the surviving rate of cropland transplanting were increased while the chromosome doubling rate decreased with the decrement of concentration of colchicines.And the chromosome doubling rate of the plants without roots was lower than those with roots.

tobacco；haploid；chromosome doubling；colchicines

2014-10-31

趙 璐(1989-)，女，河北省冀州市人，碩士研究生，Email：263542334@qq.com。

中國煙草總公司科技重大專項(xiàng)(110201301009(JY-09))。

Q943.1；S572.01

A

1001-5280(2015)03-0235-05

10.3969/j.issn.1001-5280.2015.03.04

*通信作者。