陳忠敏， 陳 梟， 龐亞妮， 李江峰， 王富平

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

研究與技術(shù)

絲膠蛋白應(yīng)用于組織工程支架材料的研究進(jìn)展

陳忠敏， 陳 梟， 龐亞妮， 李江峰， 王富平

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

家蠶絲膠蛋白是一種由18種氨基酸組成的優(yōu)質(zhì)高分子蛋白質(zhì)材料，近年來逐步被應(yīng)用到生物材料領(lǐng)域并得到重視。文章在介紹絲膠蛋白結(jié)構(gòu)及其獨特的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換性能的基礎(chǔ)上，提出應(yīng)用于醫(yī)學(xué)組織工程材料領(lǐng)域家蠶絲膠蛋白應(yīng)注重性質(zhì)穩(wěn)定性的觀點，綜述了近年來絲膠蛋白在組織工程支架材料領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展，指出了絲膠蛋白在醫(yī)學(xué)組織工程材料領(lǐng)域應(yīng)用時必須解決的關(guān)鍵問題。

絲膠蛋白； 組織工程支架材料； 生物相容性； 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

在器官移植供體極為缺乏的今天，組織工程的發(fā)展為需要各類器官的病患者帶來了福音。組織工程的核心技術(shù)在于：模擬體內(nèi)組織發(fā)生的環(huán)境，構(gòu)建由功能細(xì)胞、生物材料和生物活性分子所組成的三維空間復(fù)合體，用以制造、修復(fù)直至替代組織和器官[1]。其中生物支架是為種子細(xì)胞的黏附生長、增殖、凋亡等提供場地，其性能極為重要，影響著組織器官的最終形成?，F(xiàn)有組織工程支架存在著主動捕獲細(xì)胞、誘導(dǎo)組織生長能力弱的關(guān)鍵性缺陷，功能化組織工程支架材料的開發(fā)與研究成為了熱點問題。

基于生物支架材料對原材料的生物相容性有特殊要求，天然高分子材料較合成材料有明顯優(yōu)勢。天然材料中，膠原蛋白、纖維蛋白等蛋白質(zhì)類和殼聚糖等多糖類被使用得較多，蠶絲蛋白的天然優(yōu)勢使其在服用功能外被關(guān)注于在生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用。

蠶絲蛋白主要來自于家蠶，在中國已有幾千年的歷史。家蠶屬于完全變態(tài)的鱗翅目蠶蛾科昆蟲，家蠶絲蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的高分子動物蛋白，包括絲素蛋白和絲膠蛋白。在蠶絲絲素和絲膠兩種蛋白質(zhì)中，絲膠包覆于絲素外面對絲素起保護(hù)和黏合作用，由于其結(jié)構(gòu)特點，從古至今的絲綢生產(chǎn)中，絲膠必須在經(jīng)過繅絲、精練等工藝后被除去，否則絲綢服用性能會變差。在生物材料的應(yīng)用方面，人們也是將視線首先放在了屬于纖維蛋白的絲素上，絲膠蛋白由于其性狀變化大，性能較難調(diào)控而未受重視。隨著組織工程支架材料研究的發(fā)展，絲膠所顯示出和絲素蛋白不同的性能特征及優(yōu)勢使其越來越引起重視。本文就絲膠蛋白的結(jié)構(gòu)性能及其在組織工程支架材料領(lǐng)域的可行性研究、應(yīng)用研究等進(jìn)行綜述。

1 家蠶絲膠蛋白的結(jié)構(gòu)與性能研究結(jié)果

蠶絲蛋白主要由絲膠和絲素兩種蛋白質(zhì)組成，其中絲素約占繭層質(zhì)量的70%～80%，絲膠蛋白包覆于絲素外圍約占繭層質(zhì)量的20%～30%。研究表明，絲膠的相對分子質(zhì)量因提取部位、方法，以及測定技術(shù)、方法的不同而差異較大，其相對分子質(zhì)量從約為1.4萬到31.4萬均有報道。絲膠由18種氨基酸組成，其中含量最多的是絲氨酸、天門冬氨酸和甘氨酸，相對含量分別達(dá)到33%，15%，13%(表1[2])。絲膠氨基酸組成中含有強(qiáng)極性側(cè)基(如―OH，―COOH，―NH2等)的氨基酸含量接近70%；同時，絲膠的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲為主，含部分β折疊構(gòu)象，不含或含少量α螺旋結(jié)構(gòu)，這意味著絲膠內(nèi)部結(jié)晶區(qū)較少，多為吸水性好的無規(guī)結(jié)構(gòu)。因此，絲膠是一種水溶性較好的天然球狀蛋白[2]。

表1 絲膠氨基酸組成Tab.1 Amino acid composition of sercin

蠶絲膠蛋白的分子結(jié)構(gòu)中，既有酸性基團(tuán)(―COOH)，又有堿性基團(tuán)(―NH2、―OH)，可相互作用形成雙極離子，呈兩性性質(zhì)，且其中酸性氨基酸含量略大于堿性氨基酸含量，因此絲膠是一種弱酸性蛋白。其離子存在形式隨著溶液pH值的高和低，分別以負(fù)離子形式和正離子形式存在。絲膠蛋白的相對分子質(zhì)量較大，其粒子直徑約為1～100 nm，該大小屬于膠體粒子的范圍，因而絲膠顯示出較好的膠凝、膠溶性質(zhì)，尤其當(dāng)溶液pH值接近于它的等電點時(pH值為3.8～4.5)，絲膠凝聚、凝膠現(xiàn)象明顯[3]。絲膠具有良好的吸水澎潤性質(zhì)，其吸水到一定程度后，絲膠蛋白質(zhì)大分子的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為β折疊，此時絲膠分子與水分子之間形成氫鍵結(jié)合，構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而發(fā)生膠凝作用。而當(dāng)絲膠凝膠置于熱水中時，氫鍵易被離解，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為溶液，故其為可逆性凝膠[4-5]。

關(guān)于絲膠蛋白的結(jié)構(gòu)特征，朱良均等[6-7]對其進(jìn)行了深入研究與探討，比較了家蠶絹絲腺內(nèi)取出的絲膠蛋白和熱水溶出的絲膠蛋白橫斷面結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量及分布等，得到結(jié)論為：絹絲腺內(nèi)取出的絲膠蛋白橫斷面呈一同心圓的層狀結(jié)構(gòu)；在成繭絲時會由于吐絲時牽引、嵌合、分子鏈切斷等原因使其橫斷面呈大、小相對分子質(zhì)量的混合構(gòu)造，熱水溶出絲膠呈層狀結(jié)構(gòu)，也是由于絲膠在熱水溶出過程中分子被降解形成。正是由于這些結(jié)構(gòu)特性，使得絲膠蛋白表現(xiàn)出了較強(qiáng)的性質(zhì)環(huán)境易變性。而導(dǎo)致其性質(zhì)穩(wěn)定性差的因素除熱水外，還有pH值、溫度或有機(jī)溶劑等[8]，這些因素變化時，將發(fā)生絲膠蛋白理化性質(zhì)的改變，表現(xiàn)為溶解性下降，并導(dǎo)致生物活性發(fā)生變化。另一方面，張瑤琴等[9]的研究結(jié)果表明，從繭層或繭衣等上面提取絲膠蛋白時，同一方法和環(huán)境下提取的絲膠其部分性質(zhì)可以保持一定的穩(wěn)定，具備一定的再現(xiàn)性。這一結(jié)論對絲膠蛋白在組織工程材料上的開發(fā)應(yīng)用等研究具有參考意義。

2 絲膠在組織工程支架材料的應(yīng)用可行性研究

組織工程支架材料必須具備生物相容性和可控生物降解性，迄今為止的研究表明絲膠蛋白具有這樣的性質(zhì)。

2.1 絲膠蛋白質(zhì)的生物相容性研究

生物相容性是一個較大的概念，現(xiàn)有評價技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中內(nèi)容繁多，主要仍在于對材料的組織相容性和細(xì)胞相容性、血液相容性的評價方面。根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果，絲膠具有良好的細(xì)胞相容性。日本學(xué)者寺田聰[10]在無血清培養(yǎng)基中添加絲膠蛋白，研究絲膠蛋白對動物細(xì)胞培養(yǎng)的效用性。結(jié)果顯示，絲膠蛋白有促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞的增殖效應(yīng)，而且經(jīng)高壓蒸汽滅菌后的絲膠蛋白，與過濾除菌后的絲膠蛋白顯示出了相同的促細(xì)胞增殖效果。絲膠蛋白還顯示出了顯著的促人胎兒腎細(xì)胞株293、Hela細(xì)胞、Balb3T3小鼠纖維芽細(xì)胞等的促細(xì)胞生長性能。

Minoura N等[11]采用絲膠、絲素或兩者混合物制得的各種膜，進(jìn)行小鼠成纖細(xì)胞L929的培養(yǎng)，觀察成纖細(xì)胞的黏附情況和增殖速度發(fā)現(xiàn)，由絲膠、絲素單獨制備的膜上細(xì)胞均表現(xiàn)出良好的附著和增殖性，其對細(xì)胞黏附和增殖的促進(jìn)作用與常用的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基(膠原質(zhì))性能相當(dāng)。

坪內(nèi)纮三等[12]發(fā)現(xiàn)絲膠蛋白作為醫(yī)療材料(器官形成材料、血管內(nèi)皮形成材料)，生物工程材料(細(xì)胞培養(yǎng)床)，化妝材料(皮膚護(hù)理產(chǎn)品)時能促進(jìn)細(xì)胞生長。

盛偉華等[13]研究了不同蠶絲蛋白材料對鼠胚表皮細(xì)胞的毒性，及其影響細(xì)胞增殖的因素等，采用了MTT法及活細(xì)胞計數(shù)法進(jìn)行觀察檢測，結(jié)果顯示鼠胚表皮細(xì)胞在不論是絲素還是絲膠的各型蠶絲蛋白材料上生長，其增殖活力與細(xì)胞對照組相當(dāng)(P>0.05)，其中絲膠材料細(xì)胞毒性分級為0級(無毒)，且活細(xì)胞計數(shù)結(jié)果與 MTT檢測結(jié)果一致，結(jié)論表明各型蠶絲蛋白材料均無明顯細(xì)胞毒性，能支持鼠胚表皮細(xì)胞正常生長，具有良好的細(xì)胞相容性，但其同時也指出了微量化學(xué)試劑的殘留都將會使材料帶上細(xì)胞毒性。

陳忠敏等[14]分別從繭層和繭衣中提取絲膠蛋白，以及將從繭層中提取的絲膠進(jìn)行酶解獲取小分子絲膠蛋白多肽。采用MTT法測試了各梯度濃度下絲膠對L-929細(xì)胞的相對增殖率影響,結(jié)果表明：不同條件下提取、制備的絲膠蛋白RGR毒性評分均顯示為對細(xì)胞無毒性，且隨著絲膠濃度的增大對L-929細(xì)胞具有生長促進(jìn)作用，如圖1所示。

圖1 L-929細(xì)胞在含不同質(zhì)量濃度的繭層絲膠(Jk1)的培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curves of L-929 cells in culture medium containing cocoon shell sericin (Jk1) of different mass concentrations

而Aramwit P等[15]對絲膠的生物相容性進(jìn)行了進(jìn)一步研究。Aramwit P等選取了2只小鼠做背部全層皮膚創(chuàng)面實驗，實驗結(jié)果顯示：如果傷口用絲膠蛋白處理過，就很少會有炎癥的發(fā)生，不僅如此，在整個的實驗周期內(nèi)，用絲膠蛋白處理過的創(chuàng)口會有明顯的減小，傷口處有了很好的愈合。

Yang M等[16]制備了柞蠶絲膠膜，然后將絲膠蛋白膜浸入到磷酸鈣溶液中研究其生物礦化的能力。通過抑制磷酸鈣沉淀，硝酸銀染色等實驗進(jìn)行測定，共同的實驗結(jié)果表明，柞蠶絲膠蛋白具有吸附Ca的能力。SEM表明球形晶體能在絲膠蛋白膜上成核，通過FTIR和XRD可以證明這些晶體是羥基磷灰石。這就表明絲膠蛋白膜具有生物礦化的能力。除此之外，他們還利用MG-63細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞黏附和細(xì)胞生長活性實驗，表明絲膠蛋白膜對MG-63細(xì)胞具有優(yōu)異的生物相容性。

2.2 絲膠蛋白質(zhì)的溶解性相關(guān)研究

組織工程支架材料必須具備可控生物降解性，但對絲膠蛋白的降解性能及降解原理的直接性研究進(jìn)行得很少。由于組織工程材料在純水或體液、血液環(huán)境下使用的情況較普遍，其水溶性大小可間接推斷其降解性。早在20世紀(jì)40—80年代，日本金子英雄、小松計一等[2]就對絲膠的相對分子質(zhì)量、氨基酸組成和絲膠蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了深入研究，提出著名的“A、B”絲膠論；后來Lucas F等[17]提出“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”絲膠論，指出絲膠蛋白從與絲素直接接觸面開始到最外圍，其水溶性是逐漸增加的，說明相對于絲素蛋白的性狀同一性。現(xiàn)在通過繅絲廢水提取，或從繭層、繭絲等中提取出來的絲膠是一個氨基酸組成、結(jié)晶結(jié)構(gòu)、溶解性能均有差異的多種絲膠的混合物。這種性質(zhì)差異混合絲膠的使用，是否會對其生物降解性能帶來不確定性或不可控性，這方面的研究亟待開展。

張瑤琴等[9]采用同等提取條件從蠶繭繭層、繭衣中提取了絲膠蛋白質(zhì)，以及采用中性蛋白酶酶解繭層絲膠制備了小分子絲膠蛋白肽，經(jīng)過干燥制成樣品。將樣品配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的懸浮液，于25 ℃中振蕩保溫1 h后，高速離心取上清液烘干稱重，得到溶出的絲膠蛋白質(zhì)量，并計算其溶解率。結(jié)果表明，從成繭中以同樣提取工藝、條件下獲得的絲膠性狀較為穩(wěn)定，具再現(xiàn)性。而從繭層、繭衣中提取的絲膠蛋白質(zhì)溶解率約為20%，這20%左右的溶解物可能是最外層絲膠，而剩下80%的不溶解物可能是絲膠Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。該研究指出了絲膠溶解性與其氨基酸組成和相對分子質(zhì)量大小相關(guān)，經(jīng)過中性蛋白酶酶解制備的小分子量絲膠蛋白肽的溶解率是非酶解提取絲膠溶解率的4倍以上。

實際上，根據(jù)絲膠蛋白質(zhì)分子三級結(jié)構(gòu)，其18種氨基酸組成的球狀蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)用X射線衍射分析時，在空間上其肽鏈具有結(jié)構(gòu)域部分，存在較大空間縫隙，結(jié)構(gòu)域間能做相對運動，這種結(jié)構(gòu)可以推測其具備生物降解性。

2.3 絲膠在組織工程支架材料的應(yīng)用現(xiàn)狀及進(jìn)展

絲膠蛋白作為一種天然高分子材料，具有良好的生物相容性，能夠為復(fù)合細(xì)胞提供支撐，促進(jìn)細(xì)胞增殖。但是絲膠蛋白力學(xué)性能較差，生物降解性能還有差異，將其應(yīng)用在組織工程支架時，通常須與其他材料復(fù)合制成。

饒建偉等[18]采用絲膠、絲素共混制備絲蛋白溶液，再以氯化鈉為制孔劑制備得到三維多孔的絲蛋白支架材料，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該支架材料孔隙均勻相互貫通；同時當(dāng)絲膠蛋白的含量≥6%時支架材料的壓縮回彈率可達(dá)到100%，表明該支架材料的機(jī)械性能隨著絲膠蛋白含量的增加而增大，脂肪干細(xì)胞(ADSCs)-支架復(fù)合培養(yǎng)14 d后，進(jìn)行組織學(xué)觀察，結(jié)果顯示：ADSCs能很好地黏附于支架材料上，細(xì)胞形態(tài)良好；材料植入SD大鼠體內(nèi)60 d后進(jìn)行了組織學(xué)觀察，結(jié)果顯示：支架材料降解緩慢，有輕微的炎癥反應(yīng)且含不同絲膠蛋白比例的支架浸潤程度無明顯的差異。這一結(jié)論為進(jìn)一步研究高機(jī)械性能的絲蛋白支架材料奠定了基礎(chǔ)。

李海濱等[19]采用聚己內(nèi)酯、絲膠通過靜電紡絲技術(shù)制備得到一種三維多孔支架；將人皮膚成纖維細(xì)胞附著于該支架材料上進(jìn)行共培養(yǎng)，掃描電鏡觀察支架材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)及細(xì)胞在支架材料上增值與黏附狀況，結(jié)果顯示：通過靜電紡絲技術(shù)制備得到的PCL/SS支架材料，內(nèi)部呈相互貫通的三維多孔結(jié)構(gòu)，且纖維具有較高的精細(xì)度和均一度，同時，絲膠蛋白的二級結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯變化；絲膠蛋白的加入，改善了支架材料的親水性，也增強(qiáng)了人皮膚成纖維細(xì)胞在材料上的黏附和增殖。

王琳婷等[20]利用絲膠蛋白含有的羧基和羥基能與Ca2+緊密結(jié)合的特點，將氫氧化鈣和磷酸以濕法合成的羥基磷灰石，按一定的比例加入到濃縮后的絲膠蛋白溶液中，經(jīng)冷凍干燥制備成絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架材料,期望用于骨替代和骨缺損修復(fù)。結(jié)果表明，絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架材料的孔隙分散均勻，孔隙率達(dá)到了33.0%～62.5%；支架材料中的羥基磷灰石呈弱結(jié)晶態(tài)，與人體骨組織中羥基磷灰石的晶體態(tài)相似，絲膠蛋白分子呈β折疊結(jié)構(gòu)；隨著復(fù)合支架材料中羥基磷灰石的比例增加，材料的熱分解溫度提高，熱學(xué)性能改善，當(dāng)HA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時，彈性模量增大到15.64 MPa，呈現(xiàn)較好的結(jié)構(gòu)性能。

陳忠敏等[21]制備了絲膠/殼聚糖/甘油磷酸鈉溫敏性復(fù)合凝膠擬應(yīng)用于肝臟組織工程支架。研究得到了不同配比的絲膠/殼聚糖/甘油磷酸鈉復(fù)合材料，其可在20 ℃以下長時間保持液態(tài)，在體溫環(huán)境(37±5)℃附近、大范圍的生理pH值為6.9～7.45下快速凝膠化，適合注射型組織工程支架使用。對其結(jié)構(gòu)性能、細(xì)胞毒性及對BRL大鼠肝細(xì)胞促生長性能等進(jìn)行了全面分析，該凝膠具備較大的貫通三維孔結(jié)構(gòu)，具有較好的力學(xué)強(qiáng)度、良好的生物降解性，其降解速率可通過絲膠用量進(jìn)行調(diào)控，安全無毒，并具備了促BRL大鼠肝細(xì)胞生長性能。

陳忠敏等[22]還制備了絲膠/聚乙二醇/淀粉凝膠膜狀組織工程支架材料，絲膠/聚乙二醇質(zhì)量比為3/7，添加淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18 %時，凝膠膜力學(xué)性能最優(yōu)；不同配比絲膠/聚乙二醇/淀粉復(fù)合凝膠膜材料均具備降解性，且降解速率可以通過絲膠/聚乙二醇比例及淀粉含量得到調(diào)控。

Nayak S[23]制備得到的以絲膠為基質(zhì)通過京尼平進(jìn)行交聯(lián)的支架材料，通過3D培養(yǎng)能很好地促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的生長，并且能夠促進(jìn)傷口的愈合，有重建皮膚表皮層的功能，有望應(yīng)用到人工皮膚的移植。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，絲膠蛋白質(zhì)是一類可持續(xù)獲得的蛋白質(zhì)資源，其具有凝膠化性能，水溶性、生物可降解性優(yōu)于絲素。絲膠蛋白質(zhì)的生物相容性很好，可促進(jìn)細(xì)胞快速黏附和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，促進(jìn)組織長成。

作為一種含有18種氨基酸的球狀蛋白質(zhì)，其作為促進(jìn)細(xì)胞生長、組織再生等的載體并完成了組織再生的目的后，還能被人體組織所吸收，進(jìn)入人體循環(huán)代謝，提供康復(fù)營養(yǎng)?；诒姸鄡?yōu)勢，絲膠作為組織工程支架的研究備受關(guān)注，正逐漸成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最有前景的生物材料之一[24-26]。

絲膠作為組織工程材料具備了一定的優(yōu)勢，但仍然存在對其研究不足等問題。未來對絲膠蛋白用于組織工程材料應(yīng)用方面，還必須解決的問題包括：1)免疫原性；2)結(jié)構(gòu)性狀非均一性導(dǎo)致性質(zhì)穩(wěn)定性差；3)是否具備特異性的分子識別信號，具有促進(jìn)組織生長能力；4)具備智能化主動捕獲細(xì)胞，等等。

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Research Progress of Application of Sericin Protein in Tissue Engineering Scaffold Materials

CHEN Zhongmin, CHEN Xiao, PANG Yani, LI Jiangfeng, WANG Fuping

(College of Pharmacy and Bioengineering, Chongqing University of Technology, Chongqing 400054, China)

Sericin protein of silkworm is a high-quality macromolecular protein material composed of 18 amino acids. In recent years, it has been applied in the field of biological material gradually and importance has been attached to it. This paper puts forward that sericin protein of silkworm applied in the field of medical tissue engineering material should pay attention to stable character on the basis of introducing sericin protein structure and its unique sol-gel transformation performance, summarizes the research status and progress of sericin protein in the field of tissue engineering scaffold materials in recent years and points out key problems of the application of sericin protein in the field of medical tissue engineering materials that must be solved.

sericin protein; tissue engineering scaffold materials; biocompatibility; protein structure

doi.org/10.3969/j.issn.1001-7003.2015.04.006

2014-10-03;

2014-12-16

重慶市科委科技攻關(guān)重點項目(CSTC2012ggb 10003)

陳忠敏(1968-)，教授，主要從事功能材料、組織工程材料、藥物緩控釋材料的研究。

TQ314.1

A

1001-7003(2015)04-0025-06 引用頁碼: 041104