竇永起 陳慧彬 陳超

細(xì)胞周期調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系密切，中醫(yī)藥在治療肺癌的過程中顯著提高了治療的有效率和患者的臨床獲益率、疾病穩(wěn)定率，顯著延長腫瘤進(jìn)展時間［1］。自擬扶正散結(jié)湯是臨床經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)多年臨床實(shí)踐證明，在穩(wěn)定肺癌病灶、延緩腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及延長患者生存期等方面均有一定療效。為探討其作用機(jī)制，本研究采用小鼠lewis肺癌移植瘤模型，觀察其拆方配伍中藥對腫瘤生長、組織病理、細(xì)胞周期和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級C57BL/6小鼠90只，雄性6～8周齡，體質(zhì)重18～22 g，初進(jìn)動物時間:2013年7月26日，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號:SCXK(軍)2012-0004。其中10只用于移植瘤細(xì)胞傳代，70只建立小鼠皮下移植瘤動物模型，另外10只小鼠作為空白組，用于一般情況觀察、對比及排除小鼠非正常死亡情況。

1.2 瘤株

Lewis Lung Cancer瘤株由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院六所饋贈。

1.3 試劑及儀器

順氯氨鉑，齊魯制藥公司生產(chǎn)(批號:2030111DB)，核糖核酸酶(RNase A)(批號:SLBD3952V)由Sigma公司生產(chǎn);流式細(xì)胞儀(Cytomics FC 500，Beckman Coulter)。

1.4 分組及小鼠Lewis肺癌移植瘤模型制備

SPF級C57BL/6小鼠90只，其中10只用于移植瘤細(xì)胞傳代，其余80只隨機(jī)分為:空白組、模型組、順氯氨鉑組、益氣扶正組(簡稱扶正組)、化痰散結(jié)組(簡稱化痰組)、活血化瘀組(簡稱活血組)、清熱解毒組(簡稱解毒組)、中藥聯(lián)合組(簡稱聯(lián)用組)，每組10只。按照文獻(xiàn)方法制備小鼠Lewis移植瘤模型［2］。復(fù)蘇Lewis肺癌瘤株，在無菌條件下接種于2只C57BL/6小鼠右腋窩皮下，10天后按無菌操作程序，脫頸處死小鼠，取生長良好腫瘤組織，用生理鹽水洗凈剪碎后加生理鹽水用勻漿器研磨，臺盼藍(lán)染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)＞95%，調(diào)整腫瘤細(xì)胞懸液濃度為1×107/mL瘤細(xì)胞繼續(xù)皮下接種4只小鼠，每只接種0.l mL，如此傳代3次。除空白組外，其余組小鼠按同樣方法接種傳代完成后的肺癌移植瘤細(xì)胞。

1.5 藥品及制備

將扶正散結(jié)湯按配伍拆分為益氣扶正(簡稱扶正，由生黃芪25 g、女貞子15 g組成)，化痰散結(jié)(簡稱化痰，由半夏15 g、天南星10 g組成)，活血化瘀(簡稱活血，由莪術(shù)15 g、郁金15 g組成)，清熱解毒(簡稱解毒，由白花蛇舌草15 g、半枝蓮15 g組成)，四法聯(lián)用(簡稱聯(lián)用，由生黃芪25 g、女貞子15 g、半夏 15 g、天南星 10 g、莪術(shù) 15 g、郁金15 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮15 g組成)5個組分，以上藥物均由解放軍總醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)鑒定后，傳統(tǒng)方法水煎、過濾、60℃濃縮，參照文獻(xiàn)［3］計(jì)算各中藥組給藥量，分別配制成含生藥濃度為0.8 g/mL、0.4 g/mL、0.6 g/mL、0.6 g/mL、2.45 g/mL 的藥液，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 給藥

于接種后的第2天開始，各中藥組分別給予相應(yīng)中藥煎劑0.2 mL/d，空白組、模型組、順氯氨鉑組給予等體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃14天;順氯氨鉑組在接種的第2天開始予以腹腔注射順氯氨鉑2 mg/(kg·d)，1次/2天，共7次，其余各組同時腹腔注射生理鹽水10 mL/kg。

1.7 觀察項(xiàng)目

一般情況觀察:每日觀察各組小鼠體態(tài)、毛色、進(jìn)食、活動等情況。

抑瘤率:于給藥后第14天脫頸處死小鼠，剝?nèi)×鰤K，天平稱重，計(jì)算抑瘤率:抑瘤率=(1－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%

病理HE染色:取各組移植瘤用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，應(yīng)用組織切片蘇木素—伊紅染色法，光鏡下觀察。觀察腫瘤細(xì)胞的分布、生長狀態(tài)、核固縮、核碎裂和壞死，以及瘤組織內(nèi)微血管分布情況。

流式細(xì)胞術(shù)檢測瘤組織細(xì)胞周期:將小鼠瘤體剝離稱重后，每組取小塊瘤組織，并分別浸泡在含有PBS的平皿中，用眼科剪將瘤組織剪碎、勻漿，制成瘤細(xì)胞懸液，100目不銹鋼網(wǎng)過濾，PBS洗2次，每次1000 r/min離心5分鐘，75%乙醇固定，置于4℃冰箱內(nèi)過夜。次日離心，PBS洗1次調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL后離心，小心棄上清液，用含有終濃度為1 mg/mL RNaseA酶加100μL后混勻，之后加PI染液0.4 mL避光染色30分鐘，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡率的變化［4］，結(jié)果以細(xì)胞周期各時相細(xì)胞百分比表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。瘤重?cái)?shù)據(jù)符合正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊情況，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，采用單因素方差分析;抑瘤率數(shù)據(jù)符合正態(tài)性檢驗(yàn)但方差不齊，采用Kruskal-Wallis法秩和檢驗(yàn)，平均等級間的兩兩比較;細(xì)胞周期及凋亡率數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，兩組之間采用均數(shù)兩兩比較(Dunnett法)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Lewis肺癌小鼠一般情況觀察

接種后第六天，小鼠右前肢腋下可觸及黃豆大小瘤塊，造模后第7天，小鼠瘤體生長明顯加快。與空白組相比，造模后小鼠逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、動作遲緩、毛發(fā)無光澤，模型組小鼠出現(xiàn)拱背、喜靜、蜷縮抱團(tuán)的現(xiàn)象，順氯氨鉑組小鼠出現(xiàn)體溫降低、體重增長緩慢，各中藥組大部分小鼠行動較靈活，精神狀態(tài)一般，飲食尚可，體重增長較模型組及順氯氨鉑組快。除空白組和順氯氨鉑組外，其余組小鼠出現(xiàn)少量死亡，多由于腫瘤增長較快壓迫肺組織導(dǎo)致呼吸困難，以及后期出現(xiàn)消瘦、不進(jìn)食飲水等腫瘤惡病質(zhì)現(xiàn)象，個別小鼠因皮下腫瘤潰爛出血后，被同籠小鼠撕咬所致。

2.2 扶正散結(jié)拆方對Lewis肺癌移植瘤的瘤重及抑瘤率的影響

盡管各組有死亡，但其生存率各組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組瘤重經(jīng)單因素方差分析比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.98，P＜0.05)。兩兩比較經(jīng)Dunnett法，與模型相比，其余各組瘤重均顯著降低，各中藥組以聯(lián)用組抑瘤作用最為明顯，其次為扶正組和解毒組;各中藥組瘤重及抑瘤率獨(dú)立比較差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中聯(lián)用組抑瘤率最高，為63.63%，化痰組和活血組與聯(lián)用組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 扶正散結(jié)湯拆方各組對小鼠Lewis肺癌的抑制作用±s)

表1 扶正散結(jié)湯拆方各組對小鼠Lewis肺癌的抑制作用±s)

注:與模型組比較，a P＜0.05，b P＜0.01;與順氯氨鉑組比較c P＜0.05，d P ＜0.01;與聯(lián)合組比較，e P ＜0.05，f P ＜0.01。

組別 瘤重(g) 抑瘤率(%)空白組(n=10) — —63.63模型組(n=9) 3.10±0.76 —順氯氨鉑組(n=10) 0.92±0.34b 70.39扶正組(n=8) 1.16±0.48b 62.45化痰組(n=9) 2.06±0.51adf 33.43df活血組(n=9) 1.99±1.07adf 35.88de解毒組(n=8) 1.67±0.77bd 46.15c聯(lián)用組(n=9) 1.13±0.62b

2.3 扶正散結(jié)拆方對腫瘤組織病理學(xué)變化的影響

光鏡下觀察，腫瘤細(xì)胞形態(tài)多樣，核不對稱分裂明顯。模型組腫瘤組織中細(xì)胞生長旺盛，數(shù)量豐富排列緊密，形狀不規(guī)則，呈片狀分布，腫瘤實(shí)質(zhì)和間質(zhì)分界不清，病理性核分裂相多見，細(xì)胞壞死較少;順氯氨鉑組及各中藥組細(xì)胞數(shù)目較模型組稀疏，呈散在、條索狀分布，均可見不同程度的片狀壞死區(qū)及核固縮、核破碎溶解的現(xiàn)象。見圖1。

2.4 扶正散結(jié)拆方對Lewis肺癌移植瘤細(xì)胞周期及凋亡率的影響

細(xì)胞周期及凋亡率的比較采用單因素方差分析。G0/G1期比例各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.13，P ＜0.05)，兩兩比較經(jīng) Dunnett法，各治療組均較模型組增高;凋亡率各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.41，P ＜0.01)，兩兩比較經(jīng) Dunnett法，各治療組均較模型組顯著增加。除扶正組及活血組外，其余各組腫瘤細(xì)胞在G2/M期的比例明顯減少(P＜0.05);化痰組及解毒組在G0/G1期比例高于順氯氨鉑組及聯(lián)用組，其余拆方組盡管未顯示顯著性差異，但趨勢清晰;扶正散結(jié)各拆方組凋亡率獨(dú)立比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，以聯(lián)用組凋亡率最高，其次為解毒組、化痰組、活血組、扶正組。見表2。

3 討論

圖1 扶正散結(jié)拆方各組對腫瘤組織學(xué)的影響(HE，×400)

表2 扶正散結(jié)湯拆方各組對小鼠Lewis肺癌細(xì)胞周期的影響 ± s，%)

表2 扶正散結(jié)湯拆方各組對小鼠Lewis肺癌細(xì)胞周期的影響 ± s，%)

注:與模型組比較，a P ＜0.05，b P ＜0.01;與順氯氨鉑組比較c P ＜0.05，d P＜0.01;與聯(lián)合組比較，e P ＜0.05，f P ＜0.01。

凋亡率模型組(n=9) 22.05±6.19 11.86±4.92 66.08±10.44 9.40±1.87組別 G0/G1 S G2/M順氯氨鉑組(n=10) 39.37±2.97b 26.71±4.96a 33.92±7.21b 20.03±1.72b扶正組(n=8) 32.47±4.26a 13.49±2.85c 54.04±5.61d 13.63±0.89bdf化痰組(n=9) 50.44±2.07bce 5.45±3.28de 44.11±3.68b 17.89±0.39b活血組(n=9) 31.82±7.19a 8.95±8.54d 59.23±4.84de 14.10±2.86bdf解毒組(n=8) 51.48±6.06bce 7.86±4.79d 40.66±2.38b 19.06±0.92b聯(lián)用組(n=9) 37.32±2.45b 19.22±2.14 43.46±3.18b 19.57±0.76bd

研究表明，細(xì)胞周期調(diào)控紊亂是細(xì)胞增殖失控從而導(dǎo)致癌變的重要原因［5］。細(xì)胞周期不同時相(G1、S、G2、M)與細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)密切相關(guān)，由于細(xì)胞的周期長短主要決定于G1期時間長短，所以最重要的調(diào)控點(diǎn)是G1/S調(diào)控點(diǎn)，細(xì)胞在該點(diǎn)分析細(xì)胞內(nèi)、外的各種復(fù)雜信號以及DNA損傷情況，將信號傳遞、整合、匯集到細(xì)胞核，以決定細(xì)胞周期的長短、細(xì)胞處于靜止的G0期或誘發(fā)其凋亡。因此，影響和調(diào)控腫瘤的細(xì)胞周期在腫瘤的治療中具有重要意義。

對腫瘤細(xì)胞周期影響的觀察結(jié)果表明，拆方各組均可作用于細(xì)胞周期中的G1/S調(diào)控點(diǎn)，使腫瘤細(xì)胞停滯于G0～G1期，而不進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，以化痰組及解毒組作用最優(yōu);但在抑制荷瘤小鼠的腫瘤細(xì)胞生長及促進(jìn)凋亡方面，聯(lián)合組效果最佳，說明聯(lián)合應(yīng)用可以發(fā)揮其它組分，如扶正及活血組分，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及其它機(jī)制如增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑制腫瘤血管生成等方面的作用，這體現(xiàn)了中藥復(fù)方配伍的重要價值，也提示運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)等新技術(shù)，對中藥復(fù)方配伍的作用靶點(diǎn)及途徑進(jìn)行深入研究，對于提高中醫(yī)藥抗腫瘤的理論認(rèn)識，及提高臨床配伍運(yùn)用的合理性和有效性，具有非常重要的價值。

［1］ 劉碩．中醫(yī)藥參與治療晚期(ⅢB、Ⅳ期)NSCLC回顧性臨床研究［D］．北京:中國中醫(yī)科學(xué)院，2009．

［2］ 鐘婷．黃茂扶正湯抗腫瘤與免疫調(diào)節(jié)作用的初步研究［D］．長沙:中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，2010．

［3］ 陳奇．中藥藥理研究方法學(xué)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:1262．

［4］ 婁金麗，邱全瑛，何秀娟，等．威麥寧對小鼠Lewis肺癌細(xì)胞周期的影響［J］．北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2004，(2):41-44．

［5］ Marx J．How cells Cycle Toward Cancer［J］．Science，1994，(263):319-321．