李浩浩， 王昌勃， 于瑞海， 牟宗寶， 李 琪

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室， 山東 青島 266003)

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研究簡報

櫛江珧解剖卵的體外促熟研究?

李浩浩， 王昌勃， 于瑞海， 牟宗寶， 李 琪??

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室， 山東 青島 266003)

本研究探討了在不同濃度或不同處理時間下氨海水、5-羥色胺、多巴胺和維生素對櫛江珧(Atrinapectinata)解剖卵的促熟作用。通過體外浸泡的方法處理櫛江珧卵母細(xì)胞使其成熟，并完成人工授精。研究表明：濃度0.008%～0.014%的氨海水處理40～60min可顯著提高櫛江珧解剖卵的生發(fā)泡破裂率和受精率(P<0.05)，且胚胎的畸形率較低，櫛江珧解剖卵的促熟效果最好；而5-羥色胺、多巴胺和維生素對櫛江珧解剖卵的體外促熟的效果不明顯。通過人工授精、早期胚胎發(fā)育觀察，本研究闡明了櫛江珧卵子的最佳促熟條件，得到了育苗生產(chǎn)所需的幼蟲量，為確立櫛江珧人工育苗技術(shù)提供了基礎(chǔ)資料。

櫛江珧；體外促熟；卵細(xì)胞；濃度；時間

櫛江珧(Atrinapectinata)隸屬于軟體動物門(Mollusca)瓣鰓綱(Lamellibranchia)貽貝目(Mytiloida)江珧科(Pinnidae)江珧?qū)?Atrina)[1]，俗稱“海鍬”、“大海紅”，廣泛分布于溫、熱帶泥沙質(zhì)近海海域，在中國渤、黃、東、南海均有分布。江珧柱肉質(zhì)細(xì)嫩肥白，營養(yǎng)豐富，深受國內(nèi)外市場的歡迎[2]。近年來，由于環(huán)境污染和過度捕撈，造成櫛江珧野生資源總量急劇減少，產(chǎn)量難以滿足市場消費(fèi)需求[3]。為了提高產(chǎn)量，國內(nèi)外學(xué)者開展了櫛江珧的人工育苗和養(yǎng)殖技術(shù)等方面的研究[4-5]，發(fā)現(xiàn)櫛江珧排卵較難，即使親貝性腺飽滿、成熟度高，自然排卵和人工催產(chǎn)仍很困難，這制約了櫛江珧的人工育苗及規(guī)模化生產(chǎn)。而解剖法是一種快速、方便的育苗方式[6]，但在櫛江珧育苗中應(yīng)用很少。

貝類的繁殖中，精子活力和卵子的成熟度是決定受精作用和胚胎發(fā)育順利的關(guān)鍵因素[7]。目前，在雙殼貝類人工育苗中常會遇到如何獲取成熟卵子的問題，而雙殼貝類的卵子多是分批成熟的，解剖獲得的卵子存在成熟度不夠及發(fā)育不同步的現(xiàn)象，即使親貝性腺成熟度高，解剖獲取的卵子仍需要體外促熟，才能受精和正常發(fā)育[8]。目前，國內(nèi)外學(xué)者開展了氨海水、5-羥色胺(5-HT)、多巴胺、維生素等藥物在不同濃度、不同處理時間下對雙殼貝類解剖卵的體外促熟研究[9-12]，為櫛江珧體外促熟研究提供了借鑒。

櫛江珧?qū)儆跍p數(shù)第一次分裂中期受精，解剖出的成熟卵大都處于減數(shù)第一次分裂前期，需要對卵子促熟，才能使其成熟[13]。本實驗用不同濃度的氨海水、5-羥色胺、多巴胺和維生素在不同處理時間下對櫛江珧解剖卵進(jìn)行促熟，通過觀察生發(fā)泡破裂(Germinal Vesicle Break down, GVBD)[14]、受精和畸形情況，分析得出櫛江珧解剖卵適宜的促熟藥品及其最適濃度、最適授精時間，建立櫛江珧解剖卵的體外促熟技術(shù)，并進(jìn)行育苗生產(chǎn)應(yīng)用試驗，規(guī)?；嘤擞缟a(chǎn)所需的幼蟲，為建立相關(guān)類型貝類解剖卵的體外促熟技術(shù)和櫛江珧人工育苗提供了基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 精卵的獲得

實驗用櫛江珧親貝為煙臺海區(qū)養(yǎng)殖的成熟2～4齡貝。親貝經(jīng)過暫養(yǎng)穩(wěn)定后，挑選發(fā)育良好的親貝，解剖獲得精卵[15]。將卵液用100目篩絹濾去較大組織塊后，再用400目篩絹去除組織液和微小雜質(zhì)；精液用300目篩絹過濾，收集。檢查精卵狀態(tài)，選用活性好的精子和成熟度高的卵子用于實驗。

1.2 卵母細(xì)胞的促熟

1.2.1 藥物濃度實驗 室溫下(23±1 ℃)用10mL離心管分別加入等量卵液，再加入等量不同濃度的處理液，控制卵密度為500～1000個/mL，搖勻計時。氨海水處理濃度梯度設(shè)定為0.002%、0.008%、0.014%、0.020%和0.026%(以分析純氨水25%～26%為100%)；5-羥色胺處理濃度梯度設(shè)定為1、2、3和4 mmol/L；多巴胺處理濃度梯度設(shè)定為0.001、0.01、0.1和1 mmol/L；維生素(維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素B12、維生素B6、維生素D3、維生素E、維生素K3和維生素C混合)處理濃度梯度設(shè)定為0.5、2、10和30 mg/L，處理時間為40 min。

1.2.2 處理時間實驗 室溫下(23±1℃)，用10 mL離心管分別加入等量卵液，再加入海水、0.014%的氨海水、2 mmol/L的5-羥色胺、0.01 mmol/L的多巴胺和2 mg/L的維生素處理液，控制卵密度為500～1 000個/mL。搖勻計時，處理時間梯度設(shè)定為20、40、60、120、180和240 min。選用在正常海水中浸泡的卵母細(xì)胞作為對照，每組實驗設(shè)3個平行。

1.3 人工授精

取出處理完畢的卵液，用400目篩絹過濾，洗去處理液，加入50 mL離心管中，再滴入1～2滴活力旺盛的精子，搖勻(受精過程中多晃動)。

1.4 櫛江珧解剖授精的育苗生產(chǎn)試驗:

挑選活力好、外殼無損傷、發(fā)育良好的親貝6只(4雌2雄)，解剖獲得精卵，精子加入裝有300 mL海水的燒杯中，卵子加入有3L濃度為0.014%的氨海水的桶里，搖勻計時，浸泡卵子40～60 min。取出處理完畢的卵液，用400目篩絹過濾，洗去處理液，然后向卵液加入5mL活力好的精子，搖勻15～20 min，倒入15m3的育苗池中孵化。

1.5 觀察記錄

處理液浸泡后，取樣進(jìn)行顯微拍照，用于計算生發(fā)泡破裂率，受精2～3 h后，取樣進(jìn)行顯微拍照，照片用于計算受精率和畸形率[9]。

生發(fā)泡破裂率=生發(fā)泡破裂的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%；

受精率=卵裂的細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%；

畸形率=畸形卵裂的受精卵/總受精卵數(shù)×100%。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。用單因素方差分析(ANOVA，Duncan)對實驗組與對照組的差異進(jìn)行顯著性t檢驗，以P<0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 櫛江珧卵細(xì)胞形態(tài)變化

解剖獲得的櫛江珧卵母細(xì)胞經(jīng)過海水浸泡和藥物處理后生發(fā)泡發(fā)生了不同程度的破裂。一般情況下，生發(fā)泡破裂標(biāo)志著卵細(xì)胞的成熟[16]，因此觀察卵細(xì)胞生發(fā)泡形態(tài)，對櫛江珧解剖受精有重要的作用。生發(fā)泡未破裂的卵細(xì)胞卵質(zhì)不均勻，且卵細(xì)胞中有白色的區(qū)域(見圖1A)；生發(fā)泡破裂的卵細(xì)胞卵質(zhì)均勻，且卵細(xì)胞無白色區(qū)域(見圖1B)[17-18]。

氨海水、5-羥色胺、多巴胺、維生素等藥物對卵細(xì)胞有一定的副作用，適宜的濃度和處理時間促熟的卵細(xì)胞受精后，可以正常發(fā)育(見圖1C)；濃度過高或處理時間太長，卵子呈現(xiàn)不受精、發(fā)育過慢、發(fā)育畸形等情況(見圖1D)。

(A：生發(fā)泡未破裂的卵細(xì)胞；B：生發(fā)泡破裂的卵細(xì)胞；C：正常發(fā)育的受精卵；D：畸形卵。A: Oocytes with Germinal Vesicle; B: GVBD of oocytes; C: The normal fertilized egg; D: Malformation.)

圖1 櫛江珧卵的形態(tài)差異
Fig.1 Morphology changes of oocyte stripped fromA.pectinata

2.2 藥物濃度對櫛江珧解剖卵的促熟作用

濃度0.008%以上的氨海水顯著提高了櫛江珧解剖卵的生發(fā)泡破裂率和受精率(P<0.05)，但當(dāng)氨海水濃度超過0.020%時，畸形率顯著增大(P<0.05)(見圖2A)。5-羥色胺對櫛江珧解剖卵的體外促熟效果不明顯，不能提高生發(fā)泡破裂率和受精率，且濃度超過3 mmol/L的5-羥色胺溶液會抑制生發(fā)泡破裂和受精，導(dǎo)致畸形率顯著升高(P<0.05)(見圖2B)。多巴胺對櫛江珧解剖卵的生發(fā)泡破裂率、受精率和畸形率沒有影響(見圖2C)。維生素對櫛江珧解剖卵的體外促熟效果不明顯，不能提高生發(fā)泡破裂率和受精率，且濃度超過2mg/L的維生素溶液會抑制生發(fā)泡破裂和受精，導(dǎo)致畸形率顯著升高(P<0.05)(見圖2D)。故濃度為0.008%～0.014%的氨海水，促熟效果最好。

(圖中?與對照(濃度0)之間有顯著性差異(P<0.05)。Data with ? were significantly different from control(P<0.05).)

2.3 處理時間對櫛江珧解剖卵的促熟作用

海水、氨海水、5-羥色胺、多巴胺和維生素浸泡的卵，隨著處理時間(20～240 min)的增加，生發(fā)泡破裂率和畸形率增加，受精率先增加后減小。生發(fā)泡破裂率在40或60 min增加到最大值并保持穩(wěn)定，受精率在40或60 min增加到最大值，在180 min左右減小，畸形率在120～240 min，顯著高于其他組(P<0.05)。5-羥色胺、多巴胺和維生素的促熟效果和同時間的海水處理組一致，氨海水優(yōu)于其他各組(見圖3)。

氨海水處理40 min，浸泡卵的生發(fā)泡破裂率達(dá)到最大值90%，顯著高于同時間的海水處理組的33%(P<0.05)(見圖3A)；受精率在40 min達(dá)到最大值88%，顯著高于同時間的海水處理組的31%(P<0.05)，在240 min時，受精率顯著減小(見圖3B)；胚胎發(fā)育的畸形率方面，處理120 min時，氨海水浸泡卵的畸形率(9%左右)顯著高于同時間的海水處理組(3%)(P<0.05)，在240 min時，畸形率達(dá)到了60%(見圖3C)。故藥物處理時間范圍控制在40～60 min，促熟效果最好。

(圖中?與對照之間有顯著性差異(P<0.05)。Data with ? were significantly different from control(P<0.05).)

2.4 櫛江珧解剖授精的育苗生產(chǎn)

經(jīng)過解剖產(chǎn)卵，6個親貝(4雌2雄)，共得到0.81億粒卵，受精率為80%，在水溫26 ℃、鹽度30的海水中孵化，孵化率為78%，共選出D型幼蟲0.56億個。經(jīng)過解剖授精和人工升溫促熟產(chǎn)卵的櫛江珧親貝在產(chǎn)卵量、受精率、孵化率等方面比較沒有顯著差異[7]，因此，采用櫛江珧解剖卵的體外促熟技術(shù)，進(jìn)行櫛江珧的人工育苗是可行的。

3 討論

3.1 櫛江珧卵母細(xì)胞成熟及體外促熟的可行性

卵子的成熟度是雙殼類遺傳育種中十分關(guān)注的問題，卵母細(xì)胞的成熟對動物卵子的受精以及以后的發(fā)育過程是至關(guān)重要的，很大程度決定了育苗的成敗[19]。卵的大小和形狀，生發(fā)泡是否存在及細(xì)胞器的狀態(tài)等都被作為判斷卵成熟度的依據(jù)[20]，因此在櫛江珧解剖卵體外促熟過程中，應(yīng)選擇卵徑在65 μm左右，形狀圓整的卵細(xì)胞。解剖獲得的櫛江珧的卵母細(xì)胞處于第1次減數(shù)分裂的前期阻滯狀態(tài)，經(jīng)過激活，會在第1次減數(shù)分裂的中期發(fā)生第2次阻滯，之后通過受精作用的激活完成整個減數(shù)分裂過程，進(jìn)一步發(fā)育成D型幼蟲。本研究發(fā)現(xiàn)，生發(fā)泡未破裂的卵細(xì)胞，不受精，生發(fā)泡破裂的卵細(xì)胞，其受精率高達(dá)97%，故卵細(xì)胞生發(fā)泡破裂意味著卵母細(xì)胞的成熟。

本研究用氨海水、5-羥色胺、多巴胺和維生素對櫛江珧的解剖卵進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)氨海水能有效地促使卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂，生發(fā)泡破裂率可高達(dá)90%，受精率高達(dá)88%；5-羥色胺、多巴胺和維生素對櫛江珧解剖卵的體外促熟不明顯，不能提高生發(fā)泡破裂率和受精率。因此，氨海水可以有效的促進(jìn)櫛江珧解剖卵的成熟，這為進(jìn)一步的試驗及櫛江珧人工育苗提供了良好的基礎(chǔ)。

3.2 藥物濃度和處理時間對櫛江珧解剖卵受精發(fā)育的影響

多數(shù)研究人員認(rèn)為，生發(fā)泡破裂意味著卵母細(xì)胞啟動了減數(shù)分裂，是卵子成熟最明顯的標(biāo)志[14]，但卵母細(xì)胞的成熟最終是為了受精并發(fā)育成D型幼蟲。因此，受精率和畸形率是檢驗促熟效果的最好評定標(biāo)準(zhǔn)。但藥物濃度和處理時間對受精率和畸形率有很大的影響，多項研究表明，低濃度的藥物處理，受精率隨著濃度的增加而增加，當(dāng)濃度值超過一定值時，隨著濃度的增加，受精率降低，畸形率增大；短時間的藥物處理，受精率隨著時間的增加而增加，當(dāng)處理時間超過一定值時，隨著時間的增加，受精率降低，畸形率增大[9，17，21]。

氨海水、5-羥色胺、多巴胺和維生素濃度和處理時間對卵促熟有影響[9，21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，濃度為0.008%～0.014%的氨海水可顯著提高櫛江珧解剖卵的生發(fā)泡破裂率和受精率，且胚胎發(fā)育的畸形率較低，5-羥色胺、多巴胺和維生素對櫛江珧解剖卵的體外促熟效果不明顯；各藥物處理時間為40～60 min時，生發(fā)泡破裂率和受精率均達(dá)到最大值，畸形率較低。因此，對解剖卵體外促熟時，藥物濃度和處理時間控制在一定范圍內(nèi)，可以保證高受精率和低畸形率，對育苗的成功至關(guān)重要。

3.3 解剖授精在生產(chǎn)育苗中的應(yīng)用

對于雙殼貝類，采用解剖取卵、人工授精進(jìn)行繁育的研究報道，主要集中在太平洋牡蠣[6]、紫扇貝[23]、旗江珧[24]和菲律賓蛤仔[25]等幾種貝類中。實驗發(fā)現(xiàn)，櫛江珧解剖卵在濃度為0.008%～0.014%的氨海水處理40～60 min能夠達(dá)到很好的促熟作用，方法比較簡單，在生產(chǎn)育苗實驗中也取得了很好的效果，因而對于櫛江珧這類個體大、懷卵量大以及對外界因素刺激不敏感的雙殼貝類，解剖法在實驗及生產(chǎn)中是一種可取的方法。

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責(zé)任編輯 朱寶象

Studies on Maturation Promotion in Vitro of Oocytes Stripped from the Pen ShellAtrinapectinata

LI Hao-Hao, WANG Chang-Bo, YU Rui-Hai, MU Zong-Bao, LI Qi

(The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

To test the effect of ammonium seawater, 5-HT, dopamine and vitamin at different concentrations and times of exposure on the maturation of oocytes stripped fromAtrinapectinata, oocytes were treated with these drugsinvitro, and then fertilized artificially. Results showed that the concentration of 0.008%～0.014% of ammonium seawater and treatment time of 40～60 min on the maturation of oocytes was best, can improve germinal vesicle breakdown (GVBD) rate and fertilization rate ofA.pectinataoocytes remarkably (P<0.05), and the deformity rate was low in embryonic development. However, 5-HT, dopamine and vitamin were not obvious on the maturation of oocyte. In this research, we obtained the great amount of larvae ofA.pectinatafor the seed production, clarified the best condition on the maturation of oocytes stripped fromA.pectinatathrough artificial insemination and observation of early embryonic development. Our findings provided the basis for the artificial breeding ofA.pectinata.

Atrinapectinata; maturation improvement; oocyte; concentration; time

國家十二五科技支撐計劃項目(2011BAD13B01)；國家海洋公益性行業(yè)科研專項(201305005)；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金項目(BS2012HZ020)資助

2014-10-30；

2015-04-17

李浩浩(1991-)，男，碩士生，主要從事貝類遺傳育種研究。E-mail: haohaoli1110@126.com

??通訊作者： E-mail: qili66@ouc.edu.cn

S968.3

A

1672-5174(2015)12-038-05

10.16441/j.cnki.hdxb.20140357