牛 曉， 李 赟， 潘魯青

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266003)

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苯并[α]芘脅迫對(duì)三角褐指藻抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)活動(dòng)的影響?

牛 曉， 李 赟??， 潘魯青

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266003)

以三角褐指藻 (Phaeodactylumtricornutum)為材料，在連續(xù)4d內(nèi)，以100、400、700μg/L 3個(gè)劑量的苯并[α]芘(B[α]P)對(duì)三角褐指藻進(jìn)行脅迫試驗(yàn)，分析苯并[α]芘對(duì)三角褐指藻的毒性效應(yīng)，測(cè)定三角褐指藻的抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環(huán)非酶成分、含量及酶活性。研究表明：隨著B[α]P濃度的提高和脅迫時(shí)間的延長，B[α]P對(duì)三角褐指藻的生長抑制作用逐漸增強(qiáng)；藻細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量及總抗氧化能力(TAOC)顯著升高，兩者與脅迫強(qiáng)度的相關(guān)性系數(shù)分別為0.960和0.894；同時(shí)，AsA-GSH循環(huán)中的非酶成分抗壞血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)含量增加，相關(guān)酶谷胱甘肽還原酶(GR)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和單氫抗壞血酸還原酶(MHAR)活性普遍增加，其中，GSH含量、GR、APX和DHAR活性與藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量相關(guān)性系數(shù)分別為0.744、0.852、0.652和0.600。結(jié)果表明：AsA-GSH循環(huán)是三角褐指藻細(xì)胞對(duì)抗苯并芘脅迫、猝滅活性氧、降低膜脂過氧化的重要方式；細(xì)胞內(nèi)AsA含量、GR活性及APX活性對(duì)苯并芘脅迫響應(yīng)迅速、變化顯著，是潛在的生物指示物。

三角褐指藻； 苯并[α]芘脅迫； 抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)組分

由于工業(yè)的發(fā)展及人類活動(dòng)，多環(huán)芳烴類的有機(jī)污染物廣泛分布在包括海洋在內(nèi)的多種區(qū)域，這些污染物不僅對(duì)環(huán)境中的生物多樣性造成直接威脅，它們還通過食物鏈富集并傳遞進(jìn)而對(duì)人類的健康造成傷害。在這些受關(guān)注的PAHs污染物中苯并[α]芘(B[α]P)毒性最強(qiáng)，被國際癌癥調(diào)查組織確定為一級(jí)致癌物[1-2]，是環(huán)境監(jiān)測(cè)的目標(biāo)污染物之一。

有關(guān)B[α]P對(duì)海洋生物毒性的研究已涉及到魚類[3]、蝦蟹類[4]、貝類[5]及浮游生物[6]等，有關(guān)B[α]P脅迫生物生理生化方面的研究也已有不少報(bào)道，這些研究表明， B[α]P誘導(dǎo)的氧化損傷是導(dǎo)致毒性傷害的重要因素。

光合細(xì)胞內(nèi)存在一套完整的抗氧化體系。光合細(xì)胞中產(chǎn)生的活性氧自由基(ROS)一般首先經(jīng)超氧化物歧化酶(SOD)轉(zhuǎn)化為H2O2，產(chǎn)生的H2O2再分別經(jīng)過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、芬頓反應(yīng)(Fenton reaction)及AsA-GSH循環(huán)等幾種方式清除。其中， AsA-GSH循環(huán)廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、線粒體、葉綠體和過氧化物酶體之中，由3個(gè)氧化還原對(duì)和4種酶組成，在猝滅H2O2方面具有極為關(guān)鍵的作用[7]。目前，已有研究分別在重金屬脅迫的綠豆[8]和淡水藻類[9]、干旱的小麥[10]、漬水的康乃馨[11]和蘋果[12]、紫外線照射的藻類[13]、鹽度脅迫的小麥[14]和黃瓜[15]以及熒蒽暴露的浮萍[16]上進(jìn)行了AsA-GSH循環(huán)相關(guān)組分的變化情況。上述研究表明，各類脅迫均可以造成細(xì)胞氧化損傷，從而顯著誘導(dǎo)AsA-GSH循環(huán)活動(dòng)增強(qiáng)。但在微藻上AsA-GSH循環(huán)的活動(dòng)還未見報(bào)道，雖然B[α]P對(duì)海洋自養(yǎng)生物的毒性已有不少報(bào)道，但這些生物在B[α]P脅迫期間AsA-GSH相關(guān)成分的變化情況也仍屬未知。

本實(shí)驗(yàn)以三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)為材料，在比較苯并[α]芘對(duì)三角褐指藻生長、脂質(zhì)過氧化及抗氧化水平影響的基礎(chǔ)上，同時(shí)分析B[α]P脅迫下藻細(xì)胞內(nèi)AsA-GSH循環(huán)非酶成分含量及相關(guān)酶活性的變化，以期了解三角褐指藻AsA-GSH循環(huán)在清除體內(nèi)H2O2的可能作用，為探討三角褐指藻對(duì)B[α]P等有機(jī)毒物的解毒機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種和培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)以中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫三角褐指藻為實(shí)驗(yàn)材料。三角褐指藻培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基，250mL錐形瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)基體積200mL，三角褐指藻起始細(xì)胞濃度5×105個(gè)/mL，培養(yǎng)溫度為20℃，光照強(qiáng)度為冷熒光燈30μmol·m-2·s-1，光∶暗比為13∶11[17-18]。

1.2 實(shí)驗(yàn)梯度設(shè)置

實(shí)驗(yàn)所用B[α]P為Dr. Ehrenstorfer GmbH公司產(chǎn)品，純度為99.6%。使用二甲基亞砜(DMSO)作為助溶劑，制成B[α]P儲(chǔ)備液，儲(chǔ)備液在海水中的最大溶解度為10mg/L。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，0.01%的DMSO對(duì)三角褐指藻的生長沒有顯著抑制效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中三角褐指藻培養(yǎng)液中DMSO濃度小于0.01%。

實(shí)驗(yàn)B[α]P濃度設(shè)置根據(jù)實(shí)驗(yàn)中三角褐指藻的IC50，并結(jié)合在另一種海洋硅藻假微型海鏈藻[19]上的研究，設(shè)置B[a]P的3個(gè)濃度梯度為100、400、700μg/L，每個(gè)濃度處理設(shè)置3個(gè)平行，連續(xù)處理96h。本實(shí)驗(yàn)以B[α]P濃度與處理時(shí)間的乘積作為B[α]P的脅迫強(qiáng)度。

1.3 藻密度變化及抑制率的測(cè)定

在暴露處理過程中，每24h取1mL培養(yǎng)液，在顯微鏡(Nikon HFXⅡ)下用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)三角褐指藻細(xì)胞密度，基于細(xì)胞密度的變化，與對(duì)照組相比按如下公式計(jì)算百分抑制率(ASTM)：

I=(C-X)/C×100%。

式中：I為百分抑制率；C為對(duì)照組藻細(xì)胞數(shù)目；X為處理組藻細(xì)胞數(shù)目。

1.4 主要生理生化指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 脂質(zhì)過氧化水平的測(cè)定 脂質(zhì)過氧化水平以測(cè)定次級(jí)氧化產(chǎn)物MDA含量的方法來反映。MDA含量測(cè)定根據(jù)Wills[20]的方法稍加改進(jìn)。單位為nmol·mg-1prot-1。

1.4.2 總抗氧化能力的測(cè)定 使用TAOC分析試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京)測(cè)定總抗氧化能力，單位為U/mg prot。

1.4.3 抗壞血酸和還原型谷胱甘肽含量測(cè)定 抗壞血酸含量測(cè)定方法參照Kampfenkel等[21]的方法并稍作改進(jìn)。AsA含量單位為mmol/g鮮重。GSH含量的測(cè)定參照Anderson[22]的方法。GSH含量單位為mmol/g鮮重。

1.4.4 抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)酶活測(cè)定 參照Ma等[23]和Knorzer等[24]所描述的方法提取抗氧化酶液。隨后分別測(cè)定相關(guān)酶活性。其中，抗壞血酸過氧化物酶(APX，EC1.11.1.11)活性根據(jù)Nakano和AsAda[25]所描述的方法測(cè)定。以μmolAsA ·min-1·mg-1prot-1表示APX活性。單脫氫抗壞血酸還原酶(MDAR，EC1.6.5.4)活性根據(jù)Miyake和AsAda[26]所述的方法進(jìn)行測(cè)定。以μmolNADH·min-1·mg-1prot-1表示MDAR活性。脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR，EC1.8.5.1)活性根據(jù)Dalton等[27]所述的方法進(jìn)行測(cè)定。以nmolAsA·min-1·mg-1prot-1表示DHAR活性。谷胱甘肽還原酶(GR，EC1.6.4.2)活性根據(jù)Grace和Logan[28]所述的方法進(jìn)行測(cè)定。以nmolNADPH·min-1·mg-1prot-1表示GR活性?？偟目扇苄缘鞍诐舛葴y(cè)定依據(jù)Bradford[29]的方法并稍作改進(jìn)，使用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋白含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以3個(gè)平行組數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)表示, 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)、Duncan 檢驗(yàn)法及Pearson相關(guān)性分析，置信度0.05，差異顯著用不同字母表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 B[α]P對(duì)三角褐指藻生長的影響

基于B[α]P對(duì)三角褐指藻的毒性，本試驗(yàn)設(shè)置的B[α]P脅迫濃度均屬于亞致死濃度。結(jié)果如圖1所示，試驗(yàn)期間3個(gè)處理組微藻細(xì)胞密度均呈連續(xù)增加狀態(tài)，但與對(duì)照相比，B[α]P處理僅24h，高濃度400和700μg/L組三角褐指藻生長較對(duì)照組受到明顯抑制，48h后，低濃度100μg/L組三角褐指藻生長也受到明顯抑制。脅迫至96h，3個(gè)處理組三角褐指藻生長均有所恢復(fù)，3個(gè)處理組96h抑制率從低濃度組到高濃度組依次為16.7%、41.4%和43.1%。

圖1 三角褐指藻在不同濃度B[α]P 脅迫下的生長曲線Fig.1 Growth curves of Phaeodactylum tricornutum in different concentration of B[α]P

2.2 B[α]P對(duì)三角褐指藻脂質(zhì)過氧化水平及抗氧化能力的影響

與各處理組微藻生長相對(duì)應(yīng)，三角褐指藻體內(nèi)的MDA含量隨著處理濃度的增大及處理時(shí)間的延長而逐漸增高(見圖2A)，如B[α]P脅迫48h，100μg/L處理組微藻MDA含量一直未顯著增高，400和700μg/L處理組藻細(xì)胞的MDA的含量均顯著高于對(duì)照，700μg/L處理組MDA含量則顯著高于400μg/L處理組。脅迫72h，3個(gè)處理組微藻MDA含量均顯著高于對(duì)照，其中700μg/L處理組MDA 含量仍顯著高于100μg/L和400μg/L處理組。脅迫延至96h，100μg/L組微藻MDA含量雖較72h有所降低，仍顯著高于對(duì)照組水平，但顯著低于400μg/L組和700μg/L組。結(jié)果表明，B[α]P處理與三角褐指藻細(xì)胞MDA含量存在明顯的時(shí)間-劑量效應(yīng)。相關(guān)分析表明，B[α]P脅迫強(qiáng)度與藻細(xì)胞體內(nèi)MDA含量相關(guān)性系數(shù)為0.96，相關(guān)性顯著(P<0.05)，這說明B[α]P脅迫是藻細(xì)胞膜脂過氧化水平增加的直接原因。

3個(gè)處理組三角褐指藻TAOC的分析顯示(見圖2B)，與藻細(xì)胞MDA含量的變化相似，脅迫48h內(nèi)，隨著處理時(shí)間的延長，400和700μg/L處理組微藻抗氧化能力逐漸增強(qiáng)。脅迫72h，100μg/L組微藻的抗氧化能力也顯著高于對(duì)照，但低于400和700μg/L處理組。脅迫至96h，3個(gè)處理組微藻的TAOC均顯著高于對(duì)照組，各處理組間的TAOC也隨著B[α]P處理濃度的升高而呈顯著增高，此時(shí)，700μg/L處理組微藻總抗氧化水平達(dá)最高水平，為對(duì)照組的167%。相關(guān)分析表明，三角褐指藻體內(nèi)的總抗氧化能力與苯并芘脅迫強(qiáng)度及細(xì)胞內(nèi)的MDA含量的相關(guān)性系數(shù)均為0.89，相關(guān)性顯著(P<0.05)

圖2 三個(gè)濃度苯B[α]P處理三角褐指藻MDA含量、TAOC水平變化

2.3 B[α]P暴露期間三角褐指藻抗壞血酸和谷胱甘肽含量的變化情況

作為微藻抗氧化能力的一部分，B[α]P處理過程中，三角褐指藻內(nèi)AsA含量變化明顯(見圖3b)，僅脅迫24h，400和700μg/L處理組AsA含量已分別是對(duì)照組水平的133%和154%，均顯著高于對(duì)照。脅迫48h， 100μg/L組微藻AsA含量也達(dá)對(duì)照組的147%，而此時(shí)，700μg/L組抗壞血酸含量已達(dá)到峰值，為對(duì)照的179%，顯著高于100和400μg/L處理組。脅迫至72h，400μg/L處理組被進(jìn)一步誘導(dǎo)而顯著高于其它處理組，而100μg/L組抗壞血酸含量已與對(duì)照組水平相當(dāng)，700μg/L組三角褐指藻的抗壞血酸含量也有所降低，但仍高于對(duì)照組水平。結(jié)果顯示，AsA含量對(duì)B[α]P脅迫相當(dāng)敏感，但相關(guān)分析表明，AsA含量與脅迫強(qiáng)度、細(xì)胞內(nèi)MDA含量和總抗氧化能力相關(guān)系數(shù)分別為0.325、0.200、0.233，均無顯著的相關(guān)。

與AsA含量的變化不同，脅迫24h，3個(gè)處理組微藻的GSH含量與對(duì)照組均無顯著變化(見圖3a)。脅迫至48和72h，2個(gè)高濃度處理組微藻GSH含量均顯著高于對(duì)照，100μg/L組仍與對(duì)照組無顯著不同。脅迫延長至96h，100和700μg/L處理組微藻的GSH含量與72h時(shí)相應(yīng)組的含量相似，400μg/L組GSH含量則被誘導(dǎo)而顯著高于所有處理組，此時(shí)，該處理組微藻GSH含量為對(duì)照組的155%。相關(guān)分析表明，微藻體內(nèi)的GSH含量與B[α]P脅迫強(qiáng)度、體內(nèi)MDA含量和抗氧化能力的相關(guān)系數(shù)分別為0.68、0.74和0.70(P<0.05)，均為顯著相關(guān)。

2.4 B[α]P暴露對(duì)三角褐指藻抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)相關(guān)酶活力的影響

2.4.1 APX活性變化 三角褐指藻APX活性對(duì)B[α]P處理相當(dāng)敏感(見圖4a)，處理24h，3個(gè)處理組APX活性即被顯著誘導(dǎo)，誘導(dǎo)效應(yīng)與B[α]P濃度直接有關(guān)，400和700μg/L組的APX活性顯著高于100μg/L處理組。處理72h，700μg/L組APX活性已比對(duì)照組升高了33%，各處理組間APX的活性隨B[α]P處理濃度的升高而增高，并均達(dá)顯著水平。進(jìn)一步處理至96h，100μg/L組APX活性降低至對(duì)照組水平，700μg/L組APX活性也有所降低，與400μg/L組APX活性水平相似，仍均顯著高于對(duì)照組。相關(guān)分析表明，微藻APX活性與B[α]P脅迫強(qiáng)度、MDA含量和總抗氧化能力相關(guān)性系數(shù)分別為0.70、0.65和0.54(P<0.05)，達(dá)顯著相關(guān)水平。

圖3 三個(gè)濃度B[α]P處理三角褐指藻AsA含量、GSH含量變化

圖4 三種濃度苯并[α]芘處理三角褐指藻APX、MDAR、DHAR及GR活性變化Fig.4 The effect of BaP in three content on APX,MDAR,DHAR,GR activity of Phaeodactylum tricornutum

2.4.2 MDAR活性變化 MDAR活性變化(見圖4b)，處理24h，雖然3個(gè)處理組MDAR活性均被誘導(dǎo)增高，但只有400μg/L組的MDAR活性與對(duì)照有顯著差異。處理至48h，3個(gè)處理組MDAR活性均顯著高于對(duì)照，此時(shí)，400和700μg/L組MDAR活性分別較對(duì)照組提高了44%和42%，顯著高于100μg/L處理組。隨后3個(gè)處理組的MDAR活性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，72h時(shí)400μg/L組的MDAR活性仍顯著高于對(duì)照，至96h，3個(gè)處理組均與對(duì)照無顯著差異。相關(guān)分析表明，MDAR活性與B[α]P脅迫強(qiáng)度、MDA含量和總抗氧化能力分別為0.099、0.015、0.104，均無顯著相關(guān)。

2.4.3 DHAR活性的變化 如圖4c所示，B[α]P處理24h，高濃度700μg/L處理組DHAR活性被誘導(dǎo)，其活性是對(duì)照組的142%，其余2個(gè)處理組DHAR活性雖有增高，但與對(duì)照均無顯著差異。48h時(shí)，400μg/L組DHAR活力也迅速升高，達(dá)對(duì)照組的135%，700μg/L處理組DHAR活性有所下降，顯著低于400μg/L組。處理72h后，100μg/L組DHAR活性也顯著高于對(duì)照，但仍顯著低于其它2個(gè)處理組。持續(xù)處理96h， 3個(gè)處理組DHAR活性均顯著高于對(duì)照，處理組間DHAR活性隨著B[α]P處理濃度的增高而顯著升高。相關(guān)分析表明，DHAR活性與B[α]P脅迫強(qiáng)度、藻細(xì)胞MDA含量和總抗氧化能力相關(guān)性系數(shù)為0.68、0.60和0.63(P<0.05)，達(dá)顯著相關(guān)水平。

2.4.4 GR活性的變化 如圖4d所示，處理24h，3個(gè)處理組的GR活性即顯著高于對(duì)照，B[α]P處理濃度越高，微藻的GR活性被誘導(dǎo)得越高。隨著處理時(shí)間延長，各處理組GR活性被進(jìn)一步誘導(dǎo)，組間GR活性也隨B[α]P處理濃度的升高而顯著增高。至72h，400μg/L組的GR活性達(dá)峰值，而700μg/L組的GR活性仍繼續(xù)升高至處理96h時(shí)達(dá)最高。相關(guān)分析表明，GR活性與B[α]P脅迫強(qiáng)度、細(xì)胞內(nèi)MDA含量和總抗氧化能力的相關(guān)性系數(shù)為0.89、0.85和0.93(P<0.05)，均具有極高的相關(guān)性。

3 討論

AsA-GSH循環(huán)也稱作Halliwell-AsAda循環(huán)，該循環(huán)的非酶成分為3個(gè)氧化還原對(duì)，即還原型和氧化型的抗壞血酸(AsA/DHA)、還原型和氧化型的谷胱甘肽(GSH / GSSG)以及還原型和氧化型的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH / NADP+)，4種相關(guān)酶為，消耗AsA用以還原H2O2的抗壞血酸過氧化物酶(APX)、合成AsA的單脫氫抗壞血酸還原酶(MDAR)和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)以及生成GSH的GR。從抗氧化的角度來看，APX是直接的效應(yīng)酶，其它3個(gè)酶與形成AsA或GSH有關(guān)。AsA是許多酶促反應(yīng)或氧化還原反應(yīng)的電子提供者，能直接猝滅超氧負(fù)離子和羥基自由基，也能夠再生α-生育酚來保護(hù)膜系統(tǒng)，降低膜脂過氧化的危害[30]。GSH存在于幾乎所有的細(xì)胞原件，因?yàn)槠鋮⑴cAsA-GSH循環(huán)、維持巰基(-SH)穩(wěn)定以及作為GSTs底物[31]，被視為細(xì)胞內(nèi)對(duì)ROS引起的氧化損傷具有防御功能的關(guān)鍵物質(zhì)。

已有研究顯示，隨著細(xì)胞內(nèi)氧化脅迫加劇，膜脂過氧化程度增高，與AsA-GSH循環(huán)相關(guān)的非酶成分含量及相關(guān)酶活性多被誘導(dǎo)增高，如Nath等用砷脅迫水稻，發(fā)現(xiàn)根組織H2O2、MDA、 AsA和GSH含量普遍升高[32]。Zezulka等發(fā)現(xiàn)熒蒽可導(dǎo)致浮萍MDA含量升高，與此同時(shí)，浮萍的抗氧化水平呈誘導(dǎo)升高狀態(tài)，APX活性也受誘導(dǎo)而增強(qiáng)[16]。Anjum等發(fā)現(xiàn)Cd脅迫30d的綠豆內(nèi)AsA-GSH循環(huán)的相關(guān)酶如GR、MDAR、DHAR活性均顯著增高[8]。Saher等研究發(fā)現(xiàn)康乃馨內(nèi)MDA和過氧化物水平明顯增高時(shí)，APX、DHAR、MDAR、GR活性均被誘導(dǎo)增強(qiáng)[11]。另外在Cd脅迫的金魚藻[9]，H2O2預(yù)處理的栽培稻種子[33]，以及鹽度脅迫的魚腥藻內(nèi)[34]均發(fā)現(xiàn)這些脅迫導(dǎo)致APX活性增強(qiáng)，可對(duì)持續(xù)性的脅迫起到一定的拮抗作用。也有些研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生細(xì)胞氧化脅迫時(shí)，AsA-GSH循環(huán)相關(guān)成分的變化有時(shí)候并不完全一致，如Chakrabarty等在蘋果上的分析發(fā)現(xiàn)，氧化脅迫導(dǎo)致APX、MDAR和GR酶活性增強(qiáng)時(shí)，而DHAR活性并未出現(xiàn)誘導(dǎo)增強(qiáng)[12]。Abhay用鉛脅迫Talinumtriangulare，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其AsA和GSH含量較對(duì)照組明顯降低[35]。Talaat發(fā)現(xiàn)高鹽脅迫導(dǎo)致菜豆生長抑制，此時(shí)菜豆體內(nèi)GSH和AsA含量以及抗氧化酶活性也均低于對(duì)照組[36]。Shu等研究發(fā)現(xiàn)，鹽度脅迫導(dǎo)致黃瓜體內(nèi)AsA及GSH含量降低，APX、DHAR和GR活性降低，而MDAR活性卻升高了[15]。

作者曾同時(shí)比較了B[α]P對(duì)7種海洋微藻的毒性，結(jié)果顯示三角褐指藻對(duì)B[α]P有相當(dāng)高的耐受性[37]。本研究采用3個(gè)較低濃度的B[α]P處理三角褐指藻，旨在分析B[α]P導(dǎo)致三角褐指藻發(fā)生氧化性脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)AsA-GSH循環(huán)相關(guān)成分的變化情況。結(jié)果顯示，本研究設(shè)計(jì)的3個(gè)處理濃度比較合適，試驗(yàn)期間，各處理組隨著處理濃度的升高及處理時(shí)間的延長，藻細(xì)胞生長隨之表現(xiàn)不同程度的抑制，細(xì)胞內(nèi)MDA含量及總抗氧化能力顯著增加，二者與B[α]P脅迫強(qiáng)度的相關(guān)性系數(shù)分別為0.96和0.89，均呈高度相關(guān)關(guān)系。

在藻細(xì)胞膜脂過氧化水平增高及總抗氧化能力被誘導(dǎo)時(shí)，三角褐指藻細(xì)胞內(nèi)AsA-GSH循環(huán)的非酶成分含量增加，相關(guān)酶活均被顯著誘導(dǎo)，其中GR活性和GSH含量與體內(nèi)MDA含量及總抗氧化能力、APX活性與體內(nèi)MDA含量、DHAR活性與體內(nèi)總抗氧化能力的相關(guān)性分別達(dá)到極顯著相關(guān)水平，APX活性與體內(nèi)總抗氧化能力及DHAR活性與體內(nèi)MDA含量分別達(dá)到顯著相關(guān)水平。雖然AsA含量及MDAR活性與膜脂過氧化程度及總抗氧化能力的相關(guān)性均未達(dá)顯著水平，但AsA對(duì)B[α]P脅迫相當(dāng)敏感，含量的變化幅度最大，MDAR活性也隨著B[α]P脅迫強(qiáng)度的增大而呈現(xiàn)顯著的漲落。結(jié)果說明，AsA-GSH循環(huán)是三角褐指藻抵抗B[α]P脅迫、降低膜脂過氧化程度的重要方式。

相關(guān)性分析還顯示，三角褐指藻細(xì)胞AsA含量與MDAR活性的相關(guān)性最高，與DHAR活性及APX活性的相關(guān)性也達(dá)極顯著水平。APX活性增高，說明AsA的消耗在增加。MDAR和DHAR均參與AsA的合成，這2種酶活性的增高，表明AsA形成能力增強(qiáng)。MDAR和DHAR活性與AsA含量的相關(guān)性存在一定差異，似乎說明B[α]P脅迫期間，三角褐指藻內(nèi)MDAR形成AsA的作用有所上升。GSH含量只與循環(huán)內(nèi)GR活性顯著相關(guān)而非高度相關(guān)，似乎表明，盡管GR參與GSH的生成，但由于GSH在細(xì)胞內(nèi)的功能比較豐富，其合成及消耗的方式也可能相當(dāng)復(fù)雜，GSH含量并不只與GR活性有關(guān)。

進(jìn)一步比較AsA-GSH循環(huán)各成分在B[α]P脅迫時(shí)的變化情況，結(jié)果顯示，對(duì)B[α]P脅迫快速做出變化的組分有AsA含量、GR活性和APX活性，而GSH含量、DHAR活性及MDAR活性的變化則是在B[α]P脅迫強(qiáng)度進(jìn)一步增高時(shí)才被誘導(dǎo)增強(qiáng)，如AsA含量，僅脅迫24h， 400和700μg/L處理組AsA含量已顯著高于對(duì)照，脅迫48h， 100μg/L處理組AsA含量即達(dá)對(duì)照組的147%。而GSH含量，脅迫至48h，400和700μg/L處理組GSH含量才顯著高于對(duì)照， 100μg/L處理組的GSH含量一直與對(duì)照無顯著差異。這說明三角褐指藻AsA-GSH循環(huán)不同成分對(duì)B[α]P脅迫的反應(yīng)存在明顯不同。相對(duì)而言， AsA含量、GR活性及APX活性對(duì)B[α]P脅迫的反應(yīng)更為快速，可作為生物指示物用于生態(tài)環(huán)境安全的評(píng)價(jià)。

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責(zé)任編輯 朱寶象

Effect of Benzo [α] Pyrene on the Ascorbate-Glutathione Cycle ofPhaeodactylumtricornutum

NIU Xiao, LI Yun, PAN Lu-Qing

(The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

In order to investigate the toxic effect of benzo [α] pyrene (B[α]P) onPhaeodactylumtricornutumand understand the variation of the ascorbate-glutathione cycle of the microalgal cells during B[α]P stress, the culture ofP.tricornutumwas exposed to three doses of B[α]P for different times (24, 48, 72 and 96 h) with the level of total antioxidant capacity (TAOC) , the activity of associating enzymes and the content of including malondialdehyde (MDA), ascorbate (AsA) and glutathione (GSH) determined. The results showed that the growth ofP.tricornutumwas seriously inhibited by B[α]P, while the content of MDA and the level of total antioxidant capacity(TAOC) increased significantly. The correlation of content of MDA and the level of TAOC with stress strength of B[α]P was 0.960 and 0.894, respectively. The content of AsA and GSH increased, and the activity of enzymes including glutathione reductase (GR), ascorbate peroxidase (APX), dehydroascorbate reductase (DHAR) and monodehydroascorbate reductase (MDAR) was all induced significantly. The correlation of the content of MDA with the activity of GR, APX, DHAR and the content of GSH was 0.744, 0.852, 0.652 and 0.600, respectively, which indicated that the ascorbate-glutathione cycle inP.tricornutumhas important protection function by scavenging reactive oxygen species to reduce lipid peroxidation from B[α]P stress. The activity of GR, APX and the content of AsA could be considered as microalgal sensitive biological indicator for further study because of their quick and significantly response to B[α]P stress.

Phaeodactylumtricornutum; B[α]P stress; AsA-GSH cycle

國家海洋局海洋公益項(xiàng)目(201105013-3)資助

2014-10-08；

2015-01-15

牛 曉(1988-)， 男， 碩士生。E-mail: yaorinumber1@126.com

??通訊作者： E-mail: sxsdlwl@ouc.edu.cn

Q945.78

A

1672-5174(2015)12-030-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20140315