韓志勇 劉媛媛

目前，在醫(yī)院臨床微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定細(xì)菌主要依賴于傳統(tǒng)的生物化學(xué)反應(yīng)、分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)等方法，培養(yǎng)分純出單個(gè)細(xì)菌菌落的鑒定耗時(shí)長，即使使用自動(dòng)化細(xì)菌鑒定儀器，在時(shí)間上還是不能滿足臨床對(duì)檢測(cè)結(jié)果時(shí)效性的要求；而基于分子生物學(xué)方法進(jìn)行微生物鑒定大大地提高了靈敏度和時(shí)效性，但對(duì)工作人員技術(shù)要求高，檢測(cè)成本高，只能針對(duì)某些特定菌株，還是難以滿足臨床常規(guī)要求。自80年代初，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization－time of flight－mass spectrometry，MALDI－TOF－MS）技術(shù)就已經(jīng)成為一個(gè)用于研究與分析蛋白質(zhì)特征的有利工具，以其操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化、快速、高通量等優(yōu)勢(shì)受到青睞，并開始應(yīng)用于醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室，成為了一種新的微生物鑒定方法。然而由于儀器昂貴，一次性投入成本高，MALDI－TOF－MS在國外臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用尚未普及，在國內(nèi)臨床微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用也剛剛起步。但是，MALDI－TOF－MS質(zhì)譜技術(shù)以其固有的優(yōu)勢(shì)進(jìn)入臨床微生物診斷，發(fā)展迅速，并預(yù)計(jì)在將來徹底改變微生物實(shí)驗(yàn)室的面貌。本文就國內(nèi)外對(duì)MALDI－TOF－MS技術(shù)用于臨床微生物鑒定臨床分離菌株及細(xì)菌耐藥性研究的最新進(jìn)展做一綜述。

1 MALDI－TOF－MS 技術(shù)

MALDI－TOF－MS分析法是通過對(duì)被測(cè)樣品離子質(zhì)荷比的測(cè)定來進(jìn)行分析的一種分析方法，其基本原理是使樣品中的分析物在離子源中發(fā)生電離，生成不同質(zhì)荷比的帶電荷的離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用，形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。質(zhì)量分析器將同時(shí)進(jìn)入其中的不同質(zhì)量的離子按質(zhì)荷比大小分離。分離后的離子依次進(jìn)入離子檢測(cè)器，采集放大離子信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，繪制成質(zhì)譜圖。這些原理使MALDI－TOFMS能完成多種成分（包括蛋白質(zhì)、脂類、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其他能被離子化的分子）的分析［1，2］。同時(shí)具有樣本制備方便、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、數(shù)據(jù)庫可不斷擴(kuò)展等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)樣本微量化、高通量檢測(cè)和結(jié)果自動(dòng)分析，檢測(cè)過程從上樣到結(jié)果報(bào)告可在數(shù)分鐘內(nèi)完成。

2 在臨床微生物細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用

2.1 細(xì)菌鑒定 近年來，用MALDI－TOF－MS鑒定細(xì)菌的報(bào)道不斷增加，由于分析所需細(xì)菌的樣本量小，只需要將菌株培養(yǎng)24 h后就可分析，分析每個(gè)樣本孔需1 min左右的時(shí)間，顯示出這一技術(shù)在臨床病原菌鑒定中廣闊的應(yīng)用前景。2010年，Bizzini等［3］對(duì)使用 MALDI－TOF－MS 方法和傳統(tǒng)方法鑒定臨床分離細(xì)菌進(jìn)行了比較，用MALDI－TOF－MS鑒定1371株已用傳統(tǒng)方法鑒定完成的臨床分離株，其中1278株（93.2%）可以鑒定到種的水平，73 株（5.3%）可以鑒定到屬的水平，不能夠準(zhǔn)確鑒定的有20株（1.5%）；在被鑒定到種的水平的1278株菌中，有63（4.9%）株的鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)方法的鑒定結(jié)果不一致，其中絕大多數(shù)（42／63）不一致的結(jié)果是由系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫相關(guān)分類的差異造成的，14株是由質(zhì)譜儀的分辨率較低造成的，另外的7株是由于傳統(tǒng)方法的鑒定錯(cuò)誤。van Veen等［4］也對(duì)980株臨床分離細(xì)菌進(jìn)行了前瞻性實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明MALDI－TOF－MS對(duì)菌株進(jìn)行鑒定的準(zhǔn)確性要高于傳統(tǒng)的生化方法（92.2%和83.1%）。MALDI－TOF－MS 可以準(zhǔn)確鑒定 97.7%的腸桿菌科，92.0%發(fā)酵型革蘭陰性桿菌，94.3%的葡萄球菌，84.8%的鏈球菌及 85.2%的酵母菌。

隨著研究不斷深入，各種細(xì)菌的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫逐步完善。目前，已經(jīng)有經(jīng)食品藥品監(jiān)督管理局和國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的質(zhì)譜儀及相應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，可覆蓋包括革蘭陰性菌、革蘭陽性菌等臨床常見細(xì)菌以及真菌的不同菌屬及菌種。2011年，Benagli等［5］用 MALDI－TOF－MS與Phoenix、API和16SrDNA序列分析方法對(duì)1019株菌進(jìn)行比較研究，證明加德納菌、屎腸球菌和糞腸球菌等與其他常規(guī)方法的鑒定一致率分別為 97.4%、100.0%和100.0%，其結(jié)果與16SrDNA 序列分析幾乎完全吻合。但是鶉雞腸球菌和鏈球菌屬的鑒定一致率較低，分別為 44.4%和78.9%。國內(nèi)鮑春梅等［6］用 MALDI－TOF－MS鑒定27個(gè)菌屬和73個(gè)菌種共計(jì)1665株革蘭陰性菌，在屬和種水平上與Vitek2鑒定結(jié)果的符合率埃希菌屬為99%和99%，克雷伯菌屬為95%和90%，假單胞菌屬為94%和89%，沙雷菌屬為93%和88%，腸桿菌屬為93%和73%，并將細(xì)菌鑒定時(shí)間由16－18 h縮短到3－5 min。而鑒定氣單胞菌、弧菌和沙門菌在種的水平結(jié)果不理想，符合率僅為37%、27%和0%。

呂佳等［7］研究發(fā)現(xiàn)直接涂抹法雖操作簡(jiǎn)便，可重復(fù)性好，但相對(duì)而言，其質(zhì)譜峰的質(zhì)量易受涂抹均勻性、雜質(zhì)（如脂質(zhì)和多糖）峰等背景峰干擾，造成信噪比降低，直接影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。提取法能有效提取細(xì)菌表面蛋白，降低背景峰干擾，信噪比良好，是值得推薦使用的處理方法。

MALDI－TOF－MS技術(shù)對(duì)有些微生物，如鏈球菌屬和嗜麥芽窄食單胞菌的鑒定不盡如人意，可能與細(xì)菌之間的親緣關(guān)系相近或特殊蛋白指紋圖譜峰的特征性不明顯有關(guān)，需要在實(shí)際臨床應(yīng)用中不斷探索［4］。

2.2 真菌鑒定 采用MALDI－TOF－MS技術(shù)對(duì)真菌進(jìn)行檢測(cè)的研究相對(duì)較晚。2000年，Welham 等［8］首次對(duì) MALDI－TOFMS技術(shù)在青霉菌、小柱孢菌和紅色毛癬菌等真菌檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了初步研究。之后很多學(xué)者對(duì)MALDI－TOF－MS在致病性酵母菌和絲狀真菌檢測(cè)中的準(zhǔn)確性、檢測(cè)條件以及應(yīng)用范圍等方面進(jìn)行了更為深入地研究。

2011年，Putignani等［9］對(duì) 303 株臨床分離的酵母菌和酵母樣菌采用MALDI－TOF－MS進(jìn)行檢測(cè)，與傳統(tǒng)方法鑒定的符合率為84.8%，經(jīng)基因分型校正后，鑒定準(zhǔn)確率為91.7%，其中20株由于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)缺乏而未得到鑒定。2012年，Seyfarth 等［10］采用 MALDI－TOF－MS與API系統(tǒng)兩種方法檢測(cè)83株酵母菌，二者準(zhǔn)確率分別達(dá)到94.0%和84.3%，而MALDI－TOF－MS參考數(shù)據(jù)庫的更新較API系統(tǒng)要方便許多。McTaggart等［11］對(duì) 160株酵母菌（包括137株隱球菌和23株非隱球菌）進(jìn)行了MALDI－TOF－MS檢測(cè)，鑒定到種水平的準(zhǔn)確率為100%，而新生隱球菌鑒定到亞種水平的準(zhǔn)確度也高達(dá) 98.8%（85／86）。2012年，F(xiàn)iracative 等［12］利用 MALDI－TOFMS技術(shù)對(duì)164株新生隱球菌和格特隱球菌進(jìn)行檢測(cè)，能夠100% 準(zhǔn)確鑒定到種，而且能夠區(qū)分8個(gè)主要的分子類型。

2012年，國內(nèi)靳穎等［13］對(duì) MALDI－TOF－MS 鑒定臨床常見的酵母菌株進(jìn)行了評(píng)價(jià)，目的是確定其是否適合酵母菌的快速鑒定。實(shí)驗(yàn)中MALDI－TOF－MS對(duì)150株臨床酵母菌在屬的水平上100%可以被正確鑒定出來，在種的水平上的鑒定符合率為94%。

張明新等［14］對(duì)60株臨床分離的酵母菌研究時(shí)，用MALDI－TOF－MS鑒定的結(jié)果與Vitek compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)比對(duì)，鑒定符合率為95%（57／60），他們認(rèn)為質(zhì)譜分析前準(zhǔn)備階段是鑒定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中培養(yǎng)條件和菌落處理溶劑是重要影響因素。

MALDI－TOF－MS在絲狀真菌檢測(cè)中的應(yīng)用由于絲狀真菌具有多種形態(tài)如菌絲、分生孢子等，使得蛋白質(zhì)譜可能會(huì)因真菌的生長狀況和樣本部位的不同而發(fā)生變化，因此MALDI－TOF－MS對(duì)絲狀真菌的檢測(cè)相對(duì)落后于細(xì)菌和酵母菌，但近年來亦有不少學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了從基礎(chǔ)到臨床應(yīng)用方面的研究。Alshawa等［15］對(duì)360株臨床分離的皮膚癬菌和21株小柱孢屬菌進(jìn)行MALDI－TOF－MS檢測(cè)，鑒定到種的準(zhǔn)確率分別為 91.9%（331／360）和85.7%（18／21），27 株皮膚癬菌和3株小柱孢屬菌沒有得到鑒定是因?yàn)闆]有獲得質(zhì)譜信號(hào)，而只有2株（0.5%）皮膚癬菌鑒定錯(cuò)誤。

2.3 厭氧菌鑒定 厭氧菌感染常見于臨床深部組織及血液感染，隨著臨床對(duì)厭氧菌感染的日益重視以及細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)的提高，其培養(yǎng)陽性率也逐漸提高。厭氧菌對(duì)培養(yǎng)條件及鑒定條件要求苛刻。傳統(tǒng)生化鑒定技術(shù)易受到環(huán)境影響，且鑒定周期長，已不能滿足臨床實(shí)驗(yàn)室快速準(zhǔn)確鑒定厭氧菌的需求。厭氧菌16SrRNA基因序列法雖然有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但操作復(fù)雜、成本較高，不適合作為臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目開展。MALDI－TOF－MS是一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，具有靈敏、準(zhǔn)確、分辨率高的特點(diǎn)，而且操作簡(jiǎn)單、成本低廉，可高通量檢查樣本，為臨床微生物檢驗(yàn)提供了一種新型的有效手段。

2014年，袁梁等［16］對(duì) 56 株厭氧菌的研究表明，MALDITOF－MS與16SrRNA基因序列法鑒定的符合率為94.6%；傳統(tǒng)生化Vitek32 ANI鑒定卡與16SrRNA基因序列法鑒定結(jié)果的符合率為80.4%。MALDI－TOF－MS技術(shù)鑒定的符合率高于傳統(tǒng)生化鑒定技術(shù)。MALDI－TOF－MS儀器操作簡(jiǎn)單，即使批量鑒定也可在1－2 h完成，16SrRNA基因序列法至少需要4－6 h才能完成一個(gè)檢測(cè)周期，而Vitek32 ANI鑒定卡則需要24－72 h才能獲得結(jié)果。在快速檢測(cè)與高通量檢測(cè)方面，MALDI－TOF－MS 優(yōu)勢(shì)明顯，而且 MALDI－TOF－MS 所使用試劑價(jià)格低廉，成本也具有一定優(yōu)勢(shì)。該研究中，4株厭氧菌的鑒定結(jié)果分值小于 1.7 的占 7.1%（4／56），其中 3 株的結(jié)果與16SrRNA基因序列法的鑒定結(jié)果不一致。有學(xué)者［4］認(rèn)為這與Biotyper軟件數(shù)據(jù)庫不完善有關(guān)，Biotyper 3.0軟件包含212種厭氧菌質(zhì)譜數(shù)據(jù)，涵蓋大部分臨床常見厭氧菌，但如果希望進(jìn)一步提高鑒定成功率及擴(kuò)大使用范圍，仍需完善MALDI－TOF－MS 的數(shù)據(jù)庫。

2.4 血液及體液標(biāo)本的培養(yǎng)鑒定 部分研究人員對(duì)MALDI－TOF－MS檢測(cè)血培養(yǎng)中病原菌的方法學(xué)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。盡管研究者們使用了不同的血培養(yǎng)系統(tǒng)，但尚無證據(jù)表明血培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2009年，在1項(xiàng)為期5個(gè)月的回顧性研究中，研究者［17］對(duì)584份陽性血培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，其中562份為單一菌感染，22份為混合菌感染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示可鑒定94%的革蘭陰性桿菌，但只能鑒定67%的革蘭陽性球菌，尤其是鏈球菌無法鑒定。通過比較不同的溶劑，發(fā)現(xiàn)使用乙腈作為前處理的溶劑不利于革蘭陽性球菌的鑒定。另一項(xiàng)為期 9 w 的研究［18］發(fā)現(xiàn)，122 份陽性血培養(yǎng)標(biāo)本中，98.55%的標(biāo)本可鑒定至種屬水平，發(fā)生鑒定錯(cuò)誤的細(xì)菌主要見于鏈球菌和葡萄球菌。10株肺炎鏈球菌中有8株無法鑒定，2株雖可鑒定至種，但其所獲鑒定評(píng)分較低（1.7～2）。

通過上述研究可見，MALDI－TOF－MS快速、可靠，但對(duì)肺炎鏈球菌的鑒定尚存在一定困難，必須用其他方法確認(rèn)。如使用鏈球菌膠乳凝集試劑可成功地將肺炎鏈球菌與緩癥鏈球菌區(qū)分。

Lee 等［19］用 MALDI－TOF－MS 直接對(duì)尿液樣本鑒定腐生葡萄球菌，并與目前通用的鑒定系統(tǒng)包括BD公司的Phoenix鑒定儀、梅里埃公司的Vitek2鑒定儀和MicroScan鑒定系統(tǒng)進(jìn)行比較。通過16SrRNA和rpoB基因測(cè)序確定，鑒定正確率分別為 100%、86.7%、86.7%和93.3%。

Ferreira 等［20］用 MALDI－TOF－MS 聯(lián)合 UF－1000I流式細(xì)胞儀直接對(duì)220份細(xì)菌含量大于105 CFU／mL的尿路感染標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌鑒定，結(jié)果對(duì)最常引起尿路感染的大腸埃希菌在種的水平上的鑒定正確率分別為91.8%和92.7%。該研究表明，當(dāng)患者為單一菌感染且菌落計(jì)數(shù)達(dá)105 CFU／mL時(shí)，MALDI－TOF－MS的種屬鑒定準(zhǔn)確率可以達(dá)到90%以上，而對(duì)于混合性細(xì)菌感染尿液標(biāo)本的鑒定，其鑒定正確率會(huì)大大降低。

盡管 Nyvang 等［21］報(bào)道了用 MALDI－TOF－MS 在 30 min內(nèi)快速鑒定出1例患者腦脊液標(biāo)本中肺炎鏈球菌的結(jié)果，然而目前該技術(shù)對(duì)胸水、腹水、腦脊液、膿液等標(biāo)本的直接檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道還比較少，應(yīng)用于這些無菌部位體液中病原的直接鑒定還有待于進(jìn)一步探索。

3 在耐藥性篩查中的應(yīng)用

MALDI－TOF－MS對(duì)耐藥細(xì)菌的檢測(cè)潛能正在被逐漸挖掘。多數(shù)研究采用以下方法：①尋找耐藥菌株與敏感菌株間的特征性蛋白和圖譜峰；②通過耐藥菌株與抗生素共培養(yǎng)，然后檢測(cè)分解產(chǎn)物。2000年，Edwards等［22］在對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）的耐藥研究中發(fā)現(xiàn)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的質(zhì)譜圖中多個(gè)峰值（82～209）顯著高于甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）（37～67）的峰值，且 MRSA和MSSA 都有各自的特征峰，MRSA菌株蛋白質(zhì)指紋圖譜特征峰主要位于500～2000 質(zhì)荷比的小分子量范圍內(nèi)。2006年，Majcherczyk 等［23］研究顯示，MALDI－TOF－MS能夠區(qū)分基因型相同的不同耐藥性菌株，主要就是根據(jù)不同耐藥性菌株所具有不同的特征性圖譜。Wolters等［24］對(duì)MRSA中的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a檢測(cè)的研究結(jié)果表明，通過尋找耐藥菌株的特征性蛋白也可以確定耐藥菌，以及迅速確認(rèn)SA中的甲氧西林耐藥表型。MALDI－TOF－MS用于檢測(cè)產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶的耐藥菌，通過耐藥菌株與酶抑制劑抗生素共培養(yǎng)1－3 h，產(chǎn)生足以被質(zhì)譜儀檢測(cè)到的酶切產(chǎn)物，然后檢測(cè)分解產(chǎn)物，從而間接證明耐藥酶的存在。采用此方法已成功檢測(cè)到對(duì)氨芐西林、哌拉西林、頭孢曲松和頭孢他啶耐藥的腸桿菌科細(xì)菌及產(chǎn)NDM－1、VIM－1、KPC、OXA－48和OXA－162 型碳青霉烯酶的細(xì)菌［25］。

2003年，國內(nèi)杜宗敏等［26］研究發(fā)現(xiàn)，在76株試驗(yàn)菌株中有7株菌株鑒定結(jié)果與聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果不符，進(jìn)一步的表型耐藥性鑒定表明，有2株為甲氧苯青霉素耐藥株，其他5株為敏感株。mecA陰性的金黃色葡萄球菌也可以表現(xiàn)出耐藥表型。這可能是由于青霉素結(jié)合蛋白的基因有突變，或是β－內(nèi)酰胺酶過度表達(dá)，導(dǎo)致SA對(duì)甲氧苯青霉素耐藥的特點(diǎn)呈不均一性，另外，培養(yǎng)條件和所使用的抗生素濃度和種類都會(huì)影響到耐藥性的表型。耐藥性實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)條件和MALDI－TOF－MS鑒定時(shí)所使用的培養(yǎng)條件不同，可能會(huì)導(dǎo)致耐藥性表型的不同表現(xiàn)。

石桂英等［27］發(fā)現(xiàn)，MALDI－TOF－MS 對(duì)不同細(xì)菌耐藥性檢測(cè)能力不同，對(duì)葡萄球菌可有效鑒別其耐藥株與標(biāo)準(zhǔn)株，而對(duì)革蘭陰性桿菌尤其是腸桿菌的檢測(cè)效果較差。MALDITOF－MS將為葡萄球菌屬細(xì)菌耐藥性檢測(cè)提供一種快速鑒定方法。此外，葡萄球菌屬細(xì)菌耐藥株與標(biāo)準(zhǔn)株表面成分的差異還需進(jìn)一步研究。

2013年，王利君等［28］以125株泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌及110株碳青霉烯類敏感鮑曼不動(dòng)桿菌為研究對(duì)象，應(yīng)用質(zhì)譜儀的ClinProTool軟件分析各個(gè)峰的ROC曲線顯示358質(zhì)荷比質(zhì)譜峰與380質(zhì)荷比質(zhì)譜峰的ROC曲線下面積均為0.99，表明無論不完全水解的質(zhì)譜圖多么復(fù)雜，只要水解反應(yīng)后出現(xiàn)了質(zhì)譜峰358質(zhì)荷比與380質(zhì)荷比，即可判斷鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)OXA－23，此時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也顯示檢測(cè)靈敏度及特異度均為100%。通過此方法能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)產(chǎn)OXA－23鮑曼不動(dòng)桿菌，從而快速檢測(cè)不動(dòng)桿菌的碳青霉烯酶。

綜上所述，在早期和現(xiàn)階段的研究中，MALDI－TOF－MS不能正確地鑒定菌株是因?yàn)閿?shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株的圖譜有限，質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)不充分導(dǎo)致得分較低，以及細(xì)菌庫中沒有這些菌株，而通過國內(nèi)外不斷研究補(bǔ)充數(shù)據(jù)庫后，所有的分離株將逐步被明確地鑒定出來。MALDI－TOF－MS技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、高通量的特點(diǎn)，隨著國內(nèi)外臨床實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用及數(shù)據(jù)庫的進(jìn)一步完善，必將在微生物鑒定、分型、耐藥監(jiān)測(cè)等多方面發(fā)揮更大作用。

1 Gekenidis MT，Studer P，Wüthrich S，etal.Beyond the matrix－assisted laser desorption ionization（MALDI） biotyping workflow：in search of microorganism－specific tryptic peptides enabling discrimination of subspecies.Appl Environ Microbiol，2014，80：4234－4241.

2 Fujimura Y，Miura D.MALDIMass Spectrometry Imaging for Visualizing In Situ Metabolism of Endogenous Metabolites and Dietary Phytochemicals.Metabolites，2014，4：319－346.

3 Bizzini A，Durussel C，Bille J，etal.Performance of matrix－assisted laser desorption ionization－time of flight mass spectrometry for identification of bacterial strains routinely isolated in a clinical microbiology laboratory.JClin Microbiol，2010，48：1549－1554.

4 van Veen SQ，Claas EC，Kuijper EJ.High－throughput identification of bacteria and yeast by matrix－assisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories.JClin Microbiol，2010，48：900－907.

5 Benagli C，Rossi V，Dolina M，etal.Matrix－assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry for the identification of clinically relevant bacteria.PLoSOne，2011，6：16424.

6 鮑春梅，陳素明，崔恩博，等.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜快速鑒定革蘭陰性桿菌的研究.實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)師雜志，2012，4：96－99.

7 呂佳，盧行安，劉淑艷，等.MALDI－TOF－MS技術(shù)鑒定食源性致病菌的影響因素.分析儀器，2011，2：12－16.

8 Welham KJ，Domin MA，Johnson K，etal.Characterization of fungal spores by laser desorption／ionization time－of－flight mass spectrometry.Rapid Commun Mass Spectrom，2000，14：307－310.

9 Putignani L，Chierieo FD，Onori M，etal.MALDI－TOF mass spectrometry proteomic phenotyping of clinically relevant fungi.Mol Biosyst，2011，7：620－629.

10 Seyfarth F，Wiegand C，Erhard M，etal.Identification of yeast isolated fromdermatological patientsby MALDI－TOFmassspectrometry.Mycoses，2012，55：276－280.

11 McTaggart LR，Lei E，Richardson SE，etal.Rapid identification of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by matrix－assisted laser desorption ionization－time of flight mass spectrometry.J Clin Microbiol，2011，49：3050－3053.

12 Firacative C，Trilles L，Meyer W.MALDI－TOF MSenables the rapid identification of the major molecular types within the Cryptococcus neoformans／C.gattiispeciescomplex.PLoSONE，2012，7：e37566.

13 靳穎，楊爽風(fēng)，王俊妨，等.應(yīng)用基質(zhì)輔助激光電離飛行時(shí)間質(zhì)譜快速鑒定臨床酵母菌.中國真菌學(xué)雜志，2012，7：269－272.

14 張明新，朱敏，王玫，等.應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定常見細(xì)菌和酵母菌.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，34：988－992.

15 Alshawa K，Beretti JL，Lacroix C，etal.Successful identification of clinical dermatophyte and Neoscytalidium species by matrix－assisted laser desorption ionization－time of flight mass spectrometry.J Clin Microbiol，2012，50：2277－2281.

16 袁梁，顧海彤，耿佳靖，等.應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)鑒定臨床常見厭氧菌.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，35：327－329.

17 La Scola B，Raoult D.Direct identification of bacteria in positive blood culture bottles by matrix－assisted laser desorption ionisation time－of－flight massspectrometry.PLoSOne，2009，4：e8041.

18 Stevenson LG，Drake SK，Murray PR.Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix－assisted laser desorption ionization－time of flight mass spectrometry.J Clin Microbiol，2010，48：444－447.

19 Lee TF，Lee H，Chen CM，etal.Comparison of the accuracy of matrix－assisted laser desorption ionization－time of flight mass spectrometry with that of other commercial identification systems for identifying Staphylococcus saprophyticus in urine.J Clin Microbiol，2013，51：1563－1566.

20 Ferreira L，Sánchez－Juanes F，González－Avila M，etal.Direct identification of urinary tract pathogens from urine samples by matrix－assisted laser desorption ionization－time of flight mass spectrometry.J Clin Microbiol，2010，48：2110－2115.

21 Nyvang Hartmeyer G，Kvistholm Jensen A，Bocher S，etal.Mass spectrometry：pneumococcal meningitis verified and Brucella species identified in lessthan half an hour.Scand JInfect Dis，2010，42：716－718.

22 Edwards－Jones V，Claydon MA，Evason DJ，etal.Rapid discrimination between methicillin－sensitiveand methicillin－resistant Staphylococcus aureus by intact cell mass spectrometry.J Med Microbiol，2000，49：295－300.

23 Majcherczyk PA，McKenna T，Moreillon P，etal.The discriminatory power of MALDI－TOFmassspectrometry to differentiate between isogenic teicoplanin－susceptible and teicoplanin－resistant strainsof methicillin－resistant Staphylococcus aureus.FEMS Microbiol Lett，2006，255：233－239.

24 Wolters M，Rohde H，Maier T，etal.MALDI－TOF MSfingerprinting allowsfor discrimination of major methicillin－resistant Staphylococcus aureuslineages.Int JMed Microbiol，2011，301：64－68.

25 Sparbier K，Schubert S，Weller U，etal.Matrix－assisted laser desorption ionization－time of flight mass spectrometry－based functional assay for rapid detection of resistance againstβ－lactam antibiotics.J Clin Microbiol，2012，50：927－937.

26 杜宗敏，楊瑞馥，郭兆彪，等.金黃色葡萄球菌及其甲氧苯青霉素耐藥性的 MALDI－TOF－MS 鑒定.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2003，22：62－66.

27 石桂英，孫宗科，陳西平.應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的初步研究.衛(wèi)生研究，2008，37：82－85.

28 王利君，范艷艷，王玫.產(chǎn)OXA－23鮑曼不動(dòng)桿菌的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)研究.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34：2587－2589.