湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院（410208）賴?yán)?潘偉男 鄧水秀 鄭慧芝

湖南省長沙市雨花區(qū)圭塘街道長重社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站（410014）劉瑛

細胞膜脂質(zhì)雙分子層具有非滲透特性，它阻礙了一些多肽、蛋白質(zhì)、核酸等生物活性物質(zhì)及高分子復(fù)合物進入細胞，這些天然屏障的存在也影響了一些生物學(xué)機制的研究和某些疾病的防治。近年來，研究發(fā)現(xiàn)的一些能攜帶生物活性物質(zhì)并有效穿過多種哺乳動物細胞膜的小分子陽離子多肽——蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（protein transduction domain，PTD），成功開啟了生物活性大分子向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的大門。

1988 年Green和Frankel等首次報道了人類免疫缺陷病毒（HIV）的轉(zhuǎn)錄反式激活蛋白（TAT）可跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)入哺乳動物的細胞內(nèi)，并發(fā)現(xiàn)進入細胞的TAT蛋白定位于細胞核，與啟動子結(jié)合后，反式激活HIV病毒轉(zhuǎn)錄。1994年Fawell等報道了TAT與β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶、RNA酶、蛋白毒素等異源蛋白質(zhì)共價結(jié)合，可共同轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞內(nèi)，并證實TAT多肽是一種潛在的細胞穿膜轉(zhuǎn)導(dǎo)劑。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TAT蛋白中存在一個富含堿性氨基酸的、帶正電荷的多肽片段（第48～60位氨基酸）是TAT穿膜的功能序列，此多肽與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，故稱為PTD或細胞穿膜肽（cell penetrating peptide，CPP）。隨著研究的不斷深入，又發(fā)現(xiàn)了一些高效PTD，如黑腹果蠅觸足肽（Antp43-58）、單純皰疹Ⅰ型病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白（HSV-1 VP22）及人工合成的多聚精氨酸、PTD-3、PTD-5和CADY等[1][2]。這些PTD大多是病毒蛋白的核定位序列，能穿透生物膜，具有天然的DNA親和力。

與其他生物大分子的轉(zhuǎn)運方式相比，PTD轉(zhuǎn)導(dǎo)作用具有許多獨特之處[3]：①PTD不僅可以轉(zhuǎn)導(dǎo)酶、轉(zhuǎn)錄因子、單克隆抗體等多肽和蛋白質(zhì)，也可將與其偶聯(lián)的小分子有機化合物、寡核苷酸、DNA、噬菌體、脂質(zhì)體和納米級鐵珠等多種大小不同的其他物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞或穿過血腦屏障，且大部分的多肽和蛋白質(zhì)導(dǎo)入細胞后仍保持其生物活性。②PTD幾乎能將介導(dǎo)的外源分子導(dǎo)入所有的哺乳動物細胞，甚至包括對DNA轉(zhuǎn)染和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染都不起作用的破骨細胞與外周血單核細胞。③PTD轉(zhuǎn)導(dǎo)以濃度依賴性方式進行，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，幾乎可以達到100%，并且轉(zhuǎn)導(dǎo)作用迅速，在培養(yǎng)基中加入PTD后5min就可在細胞內(nèi)檢測到，甚至還能達到細胞最大濃度。④PTD轉(zhuǎn)導(dǎo)對細胞幾乎沒有毒性，不破壞細胞膜和血腦屏障，不被肝和脾的巨噬細胞吞噬，也不被溶酶體降解?；谏鲜鎏攸c，PTD在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中顯示出明顯優(yōu)勢和廣闊前景。

PTD均為帶正電荷的、長短不等的小分子多肽，可攜帶多種生物活性物質(zhì)入膜，其轉(zhuǎn)導(dǎo)穿膜機制存在四種理論學(xué)說：①非經(jīng)典轉(zhuǎn)導(dǎo)學(xué)說。研究發(fā)現(xiàn)PTD穿膜過程與受體介導(dǎo)無關(guān)，且使用線粒體呼吸鏈代謝抑制劑（疊氮鈉、魚藤酮等）后，PTD轉(zhuǎn)導(dǎo)不受影響，提示此作用不依賴能量，為非主動轉(zhuǎn)運。另有研究報道，PTD轉(zhuǎn)導(dǎo)在4℃時的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與37℃時基本相同，而低溫時正常的胞吞作用已經(jīng)失活，提示PTD轉(zhuǎn)導(dǎo)不以經(jīng)典的胞吞形式進行。②非經(jīng)典胞吞作用學(xué)說。研究發(fā)現(xiàn)PTD轉(zhuǎn)導(dǎo)作用因加入一些細胞內(nèi)吞作用抑制劑（秋水仙素、紫杉醇、氯喹等）而減弱，故認(rèn)為這種不同于經(jīng)典胞吞作用的途徑也存在于PTD轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中。③內(nèi)吞攝取機制學(xué)說。研究表明在細胞內(nèi)，PTD及其復(fù)合物存在于內(nèi)吞體中，可能是通過細胞膜快速靜電作用攝取PTD及其復(fù)合物，再內(nèi)吞到細胞中。④細胞攝取機制學(xué)說。研究推測PTD的穿膜機制可能是陽離子多肽與生物膜上的陰離子物質(zhì)（糖胺聚糖等）形成中性復(fù)合物，進一步激活了細胞攝取機制[4]。

PTD通常由10～16個氨基酸組成，共同結(jié)構(gòu)特點是富含精氨酸殘基，其氨基酸序列即一級結(jié)構(gòu)對PTD穿膜功能非常重要，除此之外，它們在序列和結(jié)構(gòu)上很少具有相似性。研究發(fā)現(xiàn)，PTD的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)過程可分為三個步驟：①PTD通過靜電相互作用結(jié)合在細胞膜表面，PTD氨基酸序列上的正電荷和包膜表面的負(fù)電荷相互吸引，再通過靜電作用促使PTD結(jié)合到包膜表面。②在第一步的靜電相互作用下，PTD攜帶偶聯(lián)的活性物質(zhì)以前述的四種可能機制轉(zhuǎn)導(dǎo)入膜，多聚精氨酸和TAT中精氨酸的胍基有助于PTD跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)。③PTD導(dǎo)入的活性物質(zhì)在細胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。隨后PTD在細胞內(nèi)代謝分解，并可在細胞周圍介質(zhì)中檢測到它們的降解產(chǎn)物。

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)建立了一條直接、快速、有效的新型細胞轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。PTD的應(yīng)用打破了蛋白質(zhì)常規(guī)只能通過細胞表面受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，將其所攜帶的生物信息傳遞至細胞內(nèi)的經(jīng)典規(guī)律，開辟了蛋白質(zhì)治療的新領(lǐng)域和新路徑。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)也必將成為蛋白質(zhì)功能研究和細胞內(nèi)藥物運輸?shù)挠辛ぞ?，將在疾病防治、基因治療和新藥研發(fā)等方面發(fā)揮更重要的作用。