貴州省黔南州食品藥品檢驗(yàn)所（558000）羅書香

無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其品種是否無菌的一種方法[1]，因而藥品無菌檢查是規(guī)定滅菌制劑（即注射劑、眼用制劑、植入劑等無菌藥品）質(zhì)量檢查中重要的檢驗(yàn)項(xiàng)目。歷版中國藥典均收載藥品的無菌檢查方法，《中國藥典》2005年版開始增加了無菌檢查法的方法驗(yàn)證試驗(yàn)，規(guī)定“當(dāng)建立藥品的無菌檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明采用的方法適合于該藥品的無菌檢查。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證”。供試品無菌檢查的培養(yǎng)時(shí)間也由7天修訂為14天[2]。經(jīng)過方法驗(yàn)證以確定所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查，以保證藥品無菌檢查結(jié)果的可靠性。同時(shí)國家藥典委員會(huì)《關(guān)于執(zhí)行（中國藥典）2005年版微生物限度檢查法和無菌檢查法有關(guān)問題的說明》中明確“藥品檢驗(yàn)所在進(jìn)行具體品種檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)請(qǐng)相關(guān)藥品生產(chǎn)企業(yè)提供方法驗(yàn)證資料并進(jìn)行審核”，確保藥品檢驗(yàn)順利進(jìn)行和完成。九年來，方法驗(yàn)證在促進(jìn)藥品無菌檢查科學(xué)化方面起到了積極的推動(dòng)作用，但部分驗(yàn)證資料書寫的不規(guī)范，在一定程度上也直接影響到相應(yīng)藥品品種無菌檢查的順利進(jìn)行。為了進(jìn)一步完善藥品無菌檢查的方法驗(yàn)證工作，規(guī)范驗(yàn)證資料的書寫，順利進(jìn)行和完成藥品無菌檢查。本文將我所近三年的藥品無菌檢查工作狀況并結(jié)合收集到的方法驗(yàn)證資料進(jìn)行分析和討論。

1 基本情況

1.1 近三年來，黔南州食品藥品監(jiān)督管理局稽查局抽取送交我所檢驗(yàn)的注射劑藥品481批次，我所完成無菌檢查397批次，占82.54%。因驗(yàn)證資料原因未能進(jìn)行檢查的84批次，占17.46%（其中缺驗(yàn)證資料65批次，占13.51% ；取得的驗(yàn)證資料不清、方法不明者5批次，占1.04.% ；抽取樣品不夠者14批次，占2.91%）。

1.2 在收集的416份無菌檢查方法驗(yàn)證資料中，僅提供方法描述及驗(yàn)證結(jié)論而未提供具體驗(yàn)證內(nèi)容的109份，占26.20%；供試品檢驗(yàn)量不確切的39份，占9.38%；陽性對(duì)照菌不確定的32份，占7.69%；驗(yàn)證結(jié)論表述不清的28份，占6.73%；資料不清、方法不明的5份，占1.20% 。

2 分析和討論

2.1 驗(yàn)證資料索取難，使藥品檢樣未能進(jìn)行無菌檢查，影響到藥品質(zhì)量的綜合評(píng)判。黔南州藥品檢驗(yàn)監(jiān)督工作是由州食品藥品監(jiān)督管理局稽查局抽取藥品檢樣送交到州食品藥品檢驗(yàn)所業(yè)務(wù)科，再分發(fā)到相關(guān)檢驗(yàn)科室檢驗(yàn)并出具檢驗(yàn)報(bào)告。州所業(yè)務(wù)科在收到藥品檢樣時(shí)，會(huì)及時(shí)向藥品檢樣生產(chǎn)企業(yè)聯(lián)系索取相關(guān)藥品的無菌檢查法的方法驗(yàn)證資料，大多數(shù)藥品生產(chǎn)企業(yè)都能給予積極的支持和配合，及時(shí)傳真或寄來方法驗(yàn)證資料。但少數(shù)藥品生產(chǎn)企業(yè)有的電話很難撥通，撥通了又無人接聽，或是藥企相關(guān)人員接聽了電話，并答應(yīng)很快傳真或寄出方法驗(yàn)證資料，可十天半月還未收到資料，再聯(lián)系仍無果。在481批次藥品檢樣中，因缺方法驗(yàn)證資料而未能進(jìn)行無菌檢查的檢樣就有65批次，占13.51%。

2.2 相當(dāng)一部分藥企提供的無菌檢查驗(yàn)證資料較為凌亂、很不得要領(lǐng)，未能反映試驗(yàn)方法的完整性和可行性。其提供的方法驗(yàn)證資料用很大篇幅敘述方法驗(yàn)證的目的、范圍、驗(yàn)證依據(jù)、環(huán)境、人員及儀器設(shè)備、驗(yàn)證菌種，培養(yǎng)基來源，陽性對(duì)照菌的來源及菌液的制備等，在檢測(cè)方法下，則簡(jiǎn)單地給3批樣品的培養(yǎng)結(jié)果表格。方法驗(yàn)證的結(jié)論卻是：“結(jié)果：說明供試品在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，無菌分析方法驗(yàn)證符合規(guī)定?！?或“本品按《中國藥典》2010年版無菌檢查法驗(yàn)證試驗(yàn)，無菌檢查符合規(guī)定?！被颉膀?yàn)證小組對(duì)驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)審，做出驗(yàn)證結(jié)論，并發(fā)放驗(yàn)證合格證書?！?而我們需要了解的檢驗(yàn)方法是直接接種法或是薄膜過濾法？檢驗(yàn)量是多少？薄膜過濾樣品后是否需要沖洗（沖洗液名稱？沖洗量多少？），陽性對(duì)照菌用什么菌等最基本的信息均沒有明確地反映在方法驗(yàn)證資料中。在416份方法驗(yàn)證資料中存在樣品檢驗(yàn)量不明確者39份，占9.38%；陽性對(duì)照菌不確定的者32份，占7.69%；驗(yàn)證結(jié)論表述不清的28份，占6.73% 。我們只能多次電話聯(lián)系一一確認(rèn)，才能決定是否對(duì)藥品檢樣進(jìn)行無菌檢查。這無形中占據(jù)了我們很多工作時(shí)間和精力，影響了藥品檢樣的無菌檢查工作進(jìn)度。

2.3 有的方法驗(yàn)證資料在復(fù)印、傳真過程中缺頁少行或字跡模糊難辨，致方法不明晰，可操作性差。電話聯(lián)系藥企，藥企相關(guān)人員既說不清楚，又借故推托、拖延時(shí)日，就是給不了明確肯定的答復(fù)。我們只有無奈地放棄對(duì)該藥品檢樣的無菌檢查。這在416份驗(yàn)證資料中有5份，占1.2% 。

2.4 部分方法驗(yàn)證資料驗(yàn)證方法欠妥或有誤。如穿心蓮注射液、魚腥草注射液，某些藥企的方法驗(yàn)證不采用薄膜過濾法卻采用直接接種法（分別取供試品1ml，直接接種到每管裝有15ml培養(yǎng)基的管中）。對(duì)含有抑菌成分的制劑采用直接接種法進(jìn)行無菌檢查時(shí)，由于其抑菌活性對(duì)污染菌的抑制或可殺滅作用，有可能會(huì)造成假陰性的結(jié)果而放過不合格藥品。若采用薄膜過濾法通過沖洗就可以最大限度地降低抑菌成分的作用，培養(yǎng)結(jié)果比直接接種法更加靈敏和真實(shí)。另外，直接接種法因所有成分都在培養(yǎng)基中一起培養(yǎng)，供試品濃度高時(shí)會(huì)影響培養(yǎng)基的澄清度，無法觀察結(jié)果[3]。在《中國藥典》中，無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，在建立某一藥品品種的無菌檢查方法時(shí)應(yīng)優(yōu)先采用薄膜過濾法[1]。還有，維生素B1注射液和維生素K1注射液這兩個(gè)品種，有的藥企不優(yōu)先采用薄膜過濾法而采用直接接種法，也令人費(fèi)解。

此外，有個(gè)別藥企相關(guān)人員連檢查方法的概念都不清楚。如某藥企生產(chǎn)的一個(gè)口服液制劑——康復(fù)新液，該藥品應(yīng)做的是微生物限度檢查，可寄來的卻是該藥品的無菌檢查法的方法驗(yàn)證資料?？梢姡椒?yàn)證工作任重道遠(yuǎn)。

2.5 部分方法驗(yàn)證資料中確定的供試品檢驗(yàn)量過大（達(dá)120支），影響藥品檢樣的無菌檢查項(xiàng)目檢驗(yàn)。由于這些方法驗(yàn)證資料確定的供試品檢驗(yàn)量過大，稽查局按常規(guī)抽取的樣品，在不安排做其他主要檢驗(yàn)項(xiàng)目的情況下，都不夠做無菌檢查，加上藥品經(jīng)銷商庫存樣品量有限，稽查局未能再次補(bǔ)抽樣品而使無菌檢查項(xiàng)目缺檢。此種情況在416份驗(yàn)證資料中有14份，占3.37% 。在藥品無菌檢查中，直接接種法除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接種的供試品量按表2、表3規(guī)定[1]，也就是10支（瓶）左右[若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則用的供試品支（瓶）數(shù)會(huì)更少]，分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基，總量也就是20支（瓶）。采用薄膜過濾法時(shí)，檢驗(yàn)量應(yīng)不少于直接接種法的供試品總量，按每一種培養(yǎng)基每一筒過濾接種10支（瓶）計(jì)算，采用三筒一套全密閉無菌的集菌培養(yǎng)器則需要供試品30支（瓶）。

2.6 同一藥品品種，不同的藥企其方法驗(yàn)證資料的無菌檢查法不一樣。同是采用薄膜過濾法，但在檢驗(yàn)量，陽性對(duì)照菌，沖洗液及數(shù)量，加酶方式及數(shù)量等方面各藥企的方法驗(yàn)證也差別甚大，讓人感到亂象叢生，影響到藥品無菌檢查的工作質(zhì)量和評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。以注射用頭孢他啶為例：

A藥企：檢驗(yàn)量30支，以大腸埃希菌為陽性對(duì)照菌，用0.1%蛋白胨水800ml沖洗，在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基筒中需加入240萬U·ml-1青霉素酶1ml。

B藥企：檢驗(yàn)量30支，以大腸埃希菌為陽性對(duì)照菌，用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液600 ml沖洗，在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基筒中需加入240萬U·ml-1青霉素酶2ml。

C藥企：檢驗(yàn)量10支，以金黃色葡萄球菌為陽性對(duì)照菌，用0.9%氯化鈉900 ml沖洗，在培養(yǎng)基筒中需加入300萬U·ml-1青霉素酶2ml。

D藥企：檢驗(yàn)量10g，以大腸埃希菌為陽性對(duì)照菌，用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液1000 ml沖洗，在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基筒中需加入300萬U·ml-1青霉素酶1ml，靜置15分鐘。

E藥企：檢驗(yàn)量30支，以銅綠假單孢菌為陽性對(duì)照菌，用0.1%蛋白胨水1500ml沖洗。

F藥企：檢驗(yàn)量30支，以大腸埃希菌為陽性對(duì)照菌，用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液600 ml沖洗。

3 建議

3.1 我國的藥品無菌檢查法的方法驗(yàn)證試驗(yàn)是依據(jù)《中國藥典》2005年版及附錄的要求和方法進(jìn)行的。有了依據(jù)，方法驗(yàn)證資料的內(nèi)容可簡(jiǎn)明扼要敘述，操作方法則要清晰明了、可靠、可行，驗(yàn)證結(jié)論要準(zhǔn)確清楚，要有特指性和肯定性。方法驗(yàn)證結(jié)論必須明確包含經(jīng)驗(yàn)證后的無菌檢驗(yàn)方法是直接接種法或是薄膜過濾法、供試品檢驗(yàn)量、供試液制備、薄膜過濾（幾個(gè)濾筒）樣品后是否需要沖洗（用何種沖洗液及沖洗量）、陽性對(duì)照菌等最基本的要素。例1：經(jīng)驗(yàn)證，注射用奧美拉唑鈉（60mg/支）的無菌檢查采用薄膜過濾法，方法為：取供試品20支，分別加適量的滅菌注射用水溶解，作為供試液。使用三筒一套全密閉無菌的集菌培養(yǎng)器，先用少量0.1%無菌蛋白胨水溶液過濾濕潤濾膜，再將供試液濾過培養(yǎng)器，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜三次，每膜每次50ml，沖洗畢，濾干，將硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基濾入相應(yīng)的培養(yǎng)筒，每筒100ml。以金黃色葡萄球菌為陽性對(duì)照菌。置規(guī)定溫度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 14天，逐日觀察，應(yīng)符合規(guī)定。例2：經(jīng)驗(yàn)證，碳酸氫鈉注射液（10 ml/支）的無菌檢查采用薄膜過濾法，方法為：取供試品10支，使用三筒一套全密閉無菌的集菌培養(yǎng)器直接過濾，不需沖洗，濾干，將硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基濾入相應(yīng)的培養(yǎng)筒，每筒100ml。以金黃色葡萄球菌為陽性對(duì)照菌。置規(guī)定溫度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 14天，逐日觀察，應(yīng)符合規(guī)定。

3.2 藥品無菌檢查法的方法驗(yàn)證試驗(yàn)工作是一個(gè)極繁雜耗時(shí)的操作過程，周期長，干擾因素多，控制不好很難達(dá)到驗(yàn)證的要求和效果。這就要求方法驗(yàn)證試驗(yàn)單位必須具有良好的方法驗(yàn)證試驗(yàn)條件和資質(zhì)，要求試驗(yàn)人員嚴(yán)格按照操作規(guī)范進(jìn)行操作，減少和避免方法驗(yàn)證的結(jié)果誤差。國家相關(guān)決策機(jī)構(gòu)可通過考察調(diào)研，指定具有方法驗(yàn)證試驗(yàn)資質(zhì)及條件過硬、實(shí)力雄厚的部分科研檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)及大型藥品生產(chǎn)企業(yè)分別承擔(dān)藥品標(biāo)準(zhǔn)中部分品種無菌檢查法的方法驗(yàn)證。其他藥品生產(chǎn)企業(yè)在藥品品種組分及檢驗(yàn)條件不變的前提下，就可以不再進(jìn)行方法驗(yàn)證。這樣可避免各個(gè)藥品生產(chǎn)企業(yè)重復(fù)多次的驗(yàn)證造成驗(yàn)證方法的不統(tǒng)一和驗(yàn)證資料的不規(guī)范現(xiàn)象，也節(jié)省了大量的人力物力。更為重要的是方法驗(yàn)證工作質(zhì)量得到了保證，驗(yàn)證的方法可靠可行，方法驗(yàn)證資料可資源共享，確保藥品質(zhì)量安全有效。