祝司霞

（攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)教研室，四川攀枝花 617000）

細(xì)菌生物膜的結(jié)構(gòu)及形成機(jī)制的研究進(jìn)展

祝司霞

（攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)教研室，四川攀枝花 617000）

生物膜；結(jié)構(gòu)；形成機(jī)制

難以被擺脫和清除，而且對(duì)抗生素的抵抗力比浮游細(xì)菌增強(qiáng)很多倍，所以BF感染性疾病非常頑固，經(jīng)常導(dǎo)致慢性化，難以治愈。對(duì)BF的基本結(jié)構(gòu)及形成機(jī)制的探討是研究BF的最基本的環(huán)節(jié)，

可以為更深入地揭示BF的耐藥性、抵抗性以及如何預(yù)防BF的形成，更好地清除、消滅BF，徹底治愈疾病提供理論依據(jù)。

1 BF的定義及特點(diǎn)

1.1 BF的定義 自然界中，99.9%的細(xì)菌以BF形式存在，細(xì)菌BF是細(xì)菌及其分泌的胞外多糖等物質(zhì)所形成的膜狀細(xì)菌群體，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力極強(qiáng)，是細(xì)菌抵抗外界惡劣環(huán)境的一種自我保護(hù)形式，與浮游細(xì)菌不同，它是微生物群體的聚集，細(xì)菌之間借信號(hào)分子相互交流［2］。

1.2 BF的特點(diǎn)

1.2.1 耐藥性極強(qiáng) 研究表明，成熟BF內(nèi)細(xì)菌耐藥性比浮游細(xì)菌高500～5 000倍［3］，這是由于BF具有屏障作用，防止抗生素的滲入，BF中的細(xì)菌生長(zhǎng)速度較慢，對(duì)抗生素不敏感，有的細(xì)菌能分泌抗生素分解酶，產(chǎn)生抗生素外排泵，甚至基因表達(dá)改變，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生強(qiáng)大的耐藥性。耐藥性是臨床感染遷延不愈，病原菌難以徹底清除的重要原因［4-5］，近年來，抗生素雖然廣泛應(yīng)用，但仍然無法控制細(xì)菌的感染，尤其是在小兒、老年人、長(zhǎng)期患病、免疫力低下的患者，或重癥監(jiān)護(hù)病房中，BF引起的感染更為棘手，所以目前抑制BF藥物的研究受到廣泛重視。

1.2.2 抗吞噬性極強(qiáng) 對(duì)于BF細(xì)菌，由于包裹著細(xì)菌的黏性基質(zhì)將細(xì)菌和機(jī)體免疫系統(tǒng)隔開，BF細(xì)菌可抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬，逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，使感染慢性化并難以控制［6］。研究顯示，藻酸鹽的過度表達(dá)可創(chuàng)造水合微環(huán)境，促使黏液型銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）BF的形成，可保護(hù)PABF內(nèi)的細(xì)菌免受γ-干擾素介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞攻擊，具有免疫抑制作用［7］。所以干擾BF形成過程中藻酸鹽等關(guān)鍵基因的表達(dá)，有可能降低BF細(xì)菌的抗吞噬能力。

1.2.3 黏附性極強(qiáng) BF可以通過各種復(fù)雜的機(jī)制牢固地黏附在宿主細(xì)胞或植入人體的醫(yī)用器械表面，要想用常規(guī)的清洗措施清除BF基本無效，從而造成醫(yī)院的交叉感染。近年來，隨著各類移植性生物材料（如人工瓣膜、血管支架、靜脈導(dǎo)管及關(guān)節(jié)假體等）在臨床上應(yīng)用的日益增多，附著在移植物表面的細(xì)菌BF感染也日益增多。因此，如何防止細(xì)菌形成BF及徹底清除BF，逐漸成為醫(yī)院感染控制的目標(biāo)和研究熱點(diǎn)。

目前去除BF可以用蛋白酶和纖維素酶等多種酶共同作用的方法，酶能降解信號(hào)分子或破壞BF的群體感應(yīng)系統(tǒng)；此外，Davies等［8］觀察到綠膿桿菌能產(chǎn)生一種叫順-2-癸烯酸的生物表面活性劑，它能使成熟的大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌等的BF結(jié)構(gòu)疏松，易于去除；徐卓佳等［9］研究表明，裂解性噬菌體ΦS1可以將熒光假單胞菌85%的BF去除，將幾種噬菌體聯(lián)用效果可能更好，這種方法具有天然、無毒、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；此外，滴流式反應(yīng)器可用于血流感染BF的去除，膜式反應(yīng)器可用于篩選不同表面活性劑對(duì)BF的去除效果。

2 BF的結(jié)構(gòu)

細(xì)菌BF是有三維結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞群體，其中少部分是細(xì)菌，大部分是細(xì)菌分泌的胞外聚合物，包括胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）和蛋白質(zhì)等，EPS等構(gòu)成結(jié)構(gòu)精細(xì)的網(wǎng)絡(luò)或框架，支持菌體細(xì)胞、菌體互相黏連附著在框架表面。Flem-ming等［10］認(rèn)為，細(xì)菌BF結(jié)構(gòu)類似于人類居住的社區(qū)，其中房屋是胞外聚合物，細(xì)菌是居民，住在房屋中，這種結(jié)構(gòu)堅(jiān)實(shí)穩(wěn)定，不易被破壞，使細(xì)菌的存活能力顯著提高。Moscoso等［11］用低溫掃描電子顯微鏡觀察肺炎鏈球菌BF，發(fā)現(xiàn)有小而薄的細(xì)絲連接細(xì)菌，細(xì)菌團(tuán)簇之間有水通道孔，類似蜂巢的結(jié)構(gòu)。

Lenz等［12］認(rèn)為BF的結(jié)構(gòu)具有不均質(zhì)性，分表層菌和里層菌，不同層面的細(xì)菌理化特性差異顯著，表層菌代謝活躍，分裂較快；里層菌則反之。由于細(xì)菌所處微環(huán)境不同，所以導(dǎo)致相同的細(xì)菌其基因表達(dá)模式不同，因此，不同細(xì)菌或同一細(xì)菌所處環(huán)境不同所形成的BF存在結(jié)構(gòu)差異，或疏松，或致密，厚薄不均。但目前為止盡管人們對(duì)BF的結(jié)構(gòu)開展了很多研究，仍不十分清楚。

3 BF的形成

3.1 形成過程 BF的形成受到環(huán)境因素的影響，主要受營(yíng)養(yǎng)成分的影響，此外與細(xì)菌所處的溫度、pH、水流沖刷力、介質(zhì)表面特性、滲透壓和氧化還原電位等有關(guān)。在合適的條件下，任何細(xì)菌均能形成BF。形成BF的能力因細(xì)菌而異，有的形成速度快，有的速度慢。BF的形成主要經(jīng)歷黏附、發(fā)展、成熟和播散等過程，在不同的階段，BF的化學(xué)物質(zhì)的組成比例、結(jié)構(gòu)、形態(tài)、對(duì)抗生素的敏感性和清除的難易度等差別很大。

3.1.1 菌體黏附 此期細(xì)菌黏附到宿主表面，菌體互相聚集，形成一層薄膜。尤其是在組織病變或體內(nèi)有植入的生物材料時(shí)，一些含有多糖、蛋白質(zhì)或無機(jī)物質(zhì)的體液，如尿液、血液、胃腸道液、唾液等就會(huì)很快覆蓋到這些病變組織或生物材料表面，形成一個(gè)2～10 nm的具有吸附能力的調(diào)節(jié)膜［13］，細(xì)菌會(huì)特異性黏附到調(diào)節(jié)膜表面的蛋白或多糖受體上。黏附是BF形成的關(guān)鍵步驟，黏附后的細(xì)菌不容易被流體沖走，如尿道中的大腸桿菌BF黏附牢固，不容易被尿液沖走。（1）非特異性黏附：細(xì)菌在物體表面定植的起始步驟，通常包括細(xì)菌向物體表面的移動(dòng)和微黏度的改變，而微黏度的改變會(huì)引起細(xì)菌在靠近表面時(shí)移動(dòng)性下降，這時(shí)細(xì)菌在靜電引力和范德華力的作用下，會(huì)短暫、可逆地趨向表面［14］。此外，菌體表面的附屬結(jié)構(gòu)及黏附因子也有助于菌體的黏附聚集，鞭毛的運(yùn)動(dòng)使細(xì)菌克服與宿主表面的斥力相互接觸，普通菌毛促使菌體的黏附。細(xì)菌在與物體表面的接觸過程中，經(jīng)歷了細(xì)胞形態(tài)和鞭毛合成的巨大變化，這牽扯到基因表達(dá)調(diào)控的巨大變化，細(xì)菌一旦黏附，其鞭毛合成可能被完全抑制。此期在BF的形成過程中最弱。（2）特異性黏附：主要是細(xì)菌與宿主表面進(jìn)行受體和配體間的特異性和選擇性的結(jié)合，宿主表面提供蛋白、糖蛋白和糖脂等受體，細(xì)菌借助特定蛋白黏附其上。張曉雷等［15］通過構(gòu)建尿路致病性大腸桿菌（uropathogenic escherichia coli，UPEC）黏附素基因iha敲除缺陷株，分析iha基因缺失對(duì)UPECBF形成的影響，結(jié)果表明基因缺陷菌株與野生菌株相比BF形成能力降低（P＜0.01），提示iha基因及其編碼產(chǎn)物參與UPECBF的形成，通過抑制該基因的表達(dá)有望為控制尿路感染提供新的靶點(diǎn)。李芳等［16］則認(rèn)為細(xì)菌在黏附過程中，主要產(chǎn)生EPS藻酸鹽，能連接細(xì)胞，使BF增厚，所以可以通過影響藻酸鹽合成過程中重要基因的表達(dá)，降低藻酸鹽合成限速酶GMD的活性等，來達(dá)到抑制BF形成的目的。此階段尚未形成成熟的BF，細(xì)菌抗力不強(qiáng)，容易去除，選擇此時(shí)用藥治療感染性疾病，效果相對(duì)較好。

3.1.2 BF的發(fā)展 初步形成BF后，游動(dòng)菌體不斷黏附其上，已附著的細(xì)菌大量繁殖，眾多菌體分泌大量EPS，將細(xì)胞凝結(jié)成團(tuán)塊狀，即微菌落。不同細(xì)菌或同一細(xì)菌的不同菌株微菌落的形成能力不同，葉聯(lián)華等［17］在探討ica操縱子在聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）材料表面表皮葡萄球菌BF形成中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，表皮葡萄球菌ica操縱子陽性菌株可以增加PVC材料表面BF的形成能力、細(xì)菌群落數(shù)量及BF厚度。

此期BF不斷加厚，具有剛性與柔韌性，細(xì)菌對(duì)不良環(huán)境的抵抗力更強(qiáng)，對(duì)抗生素的敏感性降低，導(dǎo)致難治性感染的發(fā)生。

3.1.3 BF的成熟 即微菌落進(jìn)一步連接、擴(kuò)大的過程，大量微菌落使細(xì)菌BF加厚并逐漸成熟。微菌落類似蘑菇狀，微菌落之間有相互連接的運(yùn)送代謝產(chǎn)物、營(yíng)養(yǎng)和廢物的通道，此時(shí)，BF是一個(gè)高度有組織的特殊功能性結(jié)構(gòu)群落。

3.1.4 細(xì)菌播散 BF成熟后，有些細(xì)菌能自我分離或受到外界作用力而從BF中脫落成為游離菌［14］，游離菌可以進(jìn)入血液引起菌血癥，或播散到它處尋找新的宿主表面并黏附，從而開始新的BF形成周期，導(dǎo)致疾病惡性循環(huán)。

3.2 形成的調(diào)控機(jī)制 在BF的形成過程中存在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制，目前學(xué)術(shù)界比較公認(rèn)的是細(xì)菌群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)。QS是指細(xì)菌根據(jù)群體密度的大小利用信號(hào)分子進(jìn)行信息交流，并調(diào)控特定基因的表達(dá)使群體行為協(xié)調(diào)。細(xì)菌合成并分泌的一些特定信號(hào)分子也稱為信息激素或自身誘導(dǎo)素（autoinducer，AI），AI主要包括作用于革蘭氏陰性菌的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類（acylhom oserine lactones，AHLs）、作用于革蘭氏陽性菌的寡肽類分子AIP（autoinducing peptide）以及革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌間的種間通用信號(hào)分子AI-2（autoinducer-2）等［18-19］。QS系統(tǒng)能幫助細(xì)菌黏附，進(jìn)而分泌大量的EPS等物質(zhì)，以形成穩(wěn)定的BF，還能使菌體感受自身密度的變化，隨著細(xì)菌密度的增加信號(hào)分子也增加，當(dāng)細(xì)菌密度達(dá)到一定閾值時(shí)，信號(hào)分子與細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中的受體結(jié)合，某些基因被激活并表達(dá)，然后發(fā)出信號(hào)并協(xié)調(diào)群體行為，避免因細(xì)菌過度生長(zhǎng)而造成空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，QS系統(tǒng)使細(xì)菌具有社會(huì)化特征［20］。因此，抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)可以防止細(xì)菌黏附或使EPS等物質(zhì)的分泌減少，從而干擾BF的形成，成為控制感染的新方向。

綜上所述，細(xì)菌BF與浮游細(xì)菌相比有許多不同的特性，給臨床治療帶來很大的麻煩。近年來，隨著相關(guān)學(xué)科的發(fā)展及研究技術(shù)的進(jìn)步，BF的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，許多問題被解決，但同時(shí)有關(guān)細(xì)菌BF的很多謎團(tuán)仍未破解，今后的研究重點(diǎn)應(yīng)放在BF形成的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)和基因調(diào)控機(jī)制上，從基因組水平和蛋白組水平來構(gòu)建BF形成模型，利用基因敲除等分子技術(shù)，揭示BF形成不同階段的分子機(jī)理，進(jìn)一步闡明BF與機(jī)體免疫關(guān)系、BF耐藥機(jī)制等問題，并為預(yù)防、控制和去除BF建立有效的策略，從而減少BF感染性疾病的發(fā)生。

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1008-2344（2015）02-0115-03 doi：10.3969/j.issn.1008-2344.2015.01.020根據(jù)美國(guó)NIH統(tǒng)計(jì)，超過80%的人類感染性疾病是由細(xì)菌生物膜（biofilm，BF）介導(dǎo)的［1］。BF的黏附能力極強(qiáng)，可以黏附在人體和各種醫(yī)用材料上（如人工關(guān)節(jié)、人工瓣膜、各種導(dǎo)管等），

2014-11-10