何莉，易小芳，羅春華(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北宜昌443000)

登革2型病毒NS1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及意義

何莉，易小芳，羅春華
(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北宜昌443000)

摘要:目的構(gòu)建登革2型病毒( DENV2) NS1基因的真核表達(dá)載體，為篩選與NS1相互作用的蛋白以及研究機(jī)體抵抗登革病毒感染的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法以DENV2感染THP1細(xì)胞的cDNA為模板，采用RT-PCR法擴(kuò)增具有Flag標(biāo)簽的NS1全長(zhǎng)基因，并將其克隆至pSG5質(zhì)粒中，構(gòu)建pSG5-NS1-Flag真核表達(dá)載體。篩選陽(yáng)性克隆，分別進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和A549細(xì)胞，Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞NS1蛋白表達(dá)。結(jié)果擴(kuò)增后具有Flag標(biāo)簽的NS1全長(zhǎng)基因片段大小為1 089 bp，與預(yù)期目的片段大小相符。載體和目的基因NS1都含1個(gè)ECORⅠ位點(diǎn)，單酶切片段大小分別為463、4 722 bp，NS1擴(kuò)增片段和pSG5質(zhì)粒的雙酶切片段大小分別為1 089、4 100 bp; 6個(gè)陽(yáng)性克隆中，5、6號(hào)克隆酶切片段符合預(yù)期大小，并經(jīng)序列鑒定證實(shí)。293T細(xì)胞和A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體后，NS1融合蛋白表達(dá)極低，轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體后均有NS1融合蛋白表達(dá)。結(jié)論本研究成功構(gòu)建了pSG5-NS1-Flag真核表達(dá)載體，為與NS1相互作用的免疫調(diào)控蛋白、NS1蛋白翻譯后修飾以及機(jī)體免疫系統(tǒng)抵御登革病毒感染機(jī)制的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:登革病毒，2型; NS1;真核表達(dá)

Construction of dengue virus serotype2 NS1 eukaryotic expression vector and its significance

HE Li，YI Xiao-fang，LUO Chun-hua
( The First Clinical Medical College of China Three Gorges University，Yichang Central People's Hospital，Yichang 443000，China)

Abstract:Objective To construct a eukaryotic expression vector of dengue virus serotype2( DENV2) NS1 gene，and to lay the foundation for screening the protein which was interacting with NS1 and for the mechanism of being against the dengue virus infection.Methods NS1-Flag sequence was amplified from the DENV2-infected THP1 genomic DNA by RTPCR and cloned into pSG5 plasmid to construct the pSG5-NS1-Flag eukaryotic expression vector.Positive clones were screened and then were identified by the enzyme digestion and sequencing.The eukaryotic expression vector was transfected into 293T cells and A549 cells by lipofection transfection.The expression of NS1 protein was detected by Western blotting.Results The full-length gene fragment size of NS1after amplification which had the Flag label was 1 089 bp，and was consistent with the expected one.The carrier and NS1 gene both contained 1 of ECORⅠsite，the single enzyme fragment sizes were 463 and 4 722 bp，respectively; the amplified fragment size of NS1 and the double enzyme fragment size of pSG5 plasmid were 1 089 and 4 100 bp，respectively.During the six positive clones，the target bands of clone 5 and clone 6 were consistent with the expected results and were identified by sequence identification.The NS1 fusion protein expression was extremely low after 293T cells and A549 cells were transfected by empty vector，after the transfection of eukaryotic expression vector，there was the NS1 protein expression.Conclusion The pSG5-NS1-Flag eukaryotic expression vector is successfully constructed，which paves the way for studying interaction between NS1 and immunomodulatory protein，post-translational modification and the mechanism of the body's immune system against dengue virus infection.

Key words:dengue virus，serotype 2; NS1; eukaryotic expression

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，目前有超過25億人生活在登革病毒( DENV)感染區(qū)，登革熱已成為世界上嚴(yán)重的蟲媒傳染病之一［1］。DENV屬于黃病毒科黃病毒屬，共分為4個(gè)血清型( DENV1～4)［2］，其國(guó)際參考株分別是登革1～4型病毒株，主要由感染的埃及伊蚊和白紋伊蚊叮咬敏感脊椎動(dòng)物宿主而傳播。DENV的基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)度約為10 kb，依次編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(包括衣殼蛋白、膜蛋白及其前體、包膜蛋白)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白( NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)［3］。NS1蛋白是惟一能同時(shí)在細(xì)胞表面表達(dá)并分泌到細(xì)胞外的非結(jié)構(gòu)蛋白，具有強(qiáng)免疫原性［4］。研究表明，NS1蛋白在DENV感染和免疫過程中發(fā)揮著重要作用［5］。2013 年2月～2014年3月，我們構(gòu)建了DENV2的NS1基因真核表達(dá)載體(具有Flag標(biāo)簽)，并在人真核細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)驗(yàn)證，以期為后續(xù)篩選與NS1相互作用的蛋白以及研究機(jī)體抵抗DENV感染作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料DENV2由廣州市疾病預(yù)防控制中心提供。THP-1細(xì)胞、人真核細(xì)胞( 293T細(xì)胞、A549細(xì)胞)、PFU高保真聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectami-neTM2000均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自美國(guó)NEB公司，小鼠抗β-actin單克隆抗體、小鼠抗Flag單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，蛋白電泳、SDS-PAGE膠、Western blotting試劑和蛋白marker均購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 pSG5-NS1-Flag真核表達(dá)載體的構(gòu)建THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS和1%抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO2。以DENV2感染THP1細(xì)胞的cDNA為模板，采用RTPCR法擴(kuò)增具有Flag標(biāo)簽的NS1全長(zhǎng)基因。根據(jù)NS1基因序列( GenBank序列號(hào)為U87411.1)，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增NS1基因全長(zhǎng)閱讀框引物，上游引物: 3'-CGCGGATCCATGGATAGTGGTTGCGTTGT-5'，BamHⅠ酶切位點(diǎn)為GGATCC部分;下游引物: 3'-CCGCTCGAGCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCACCACCACCAGCTGTGACCAAGGAGTT-5'，XhoⅠ酶切位點(diǎn)為CTCGAG部分，F(xiàn)lag標(biāo)簽為CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC部分，Gly鉸鏈為ACCACCACC部分。PCR反應(yīng)體系為50 μL，擴(kuò)增反應(yīng)條件: 94℃2 min，94℃15 s，50～60℃30 s，68℃100 s，共36個(gè)循環(huán); 68℃延伸10 min。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并回收純化。按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行質(zhì)粒提取及DNA片段膠回收，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pSG5質(zhì)粒中構(gòu)建pSG5-NS1-Flag真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后篩選陽(yáng)性克隆。

1.3酶切及序列鑒定對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行ECORⅠ單酶切鑒定，將NS1擴(kuò)增片段和pSG5質(zhì)粒分別用BamHⅠ和XhoⅠ剪切酶進(jìn)行雙酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳回收片段后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后挑取菌落進(jìn)行酶切鑒定。將酶切鑒定符合標(biāo)準(zhǔn)的陽(yáng)性克隆送往上海英韋創(chuàng)津生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列鑒定，驗(yàn)證插入片段序列。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染采用含5% FBS 和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞和A549細(xì)胞，培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO2。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞和A549細(xì)胞，分別接種于12孔板中(每孔3×105個(gè)細(xì)胞)，細(xì)胞貼壁后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法按照Lipofectami-neTM2000操作說(shuō)明將pSG5-NS1-Flag質(zhì)粒DNA與Lipofectami-neTM2000混合物( 2.5 μL/μg)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，24 h后收獲細(xì)胞。

1.5細(xì)胞NS1蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blot ting法。將空載體及不同質(zhì)量( 0.1、0.2、0.3 μg)的重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞中，將空載體及不同質(zhì)量( 0.2、0.3、0.4 μg)的重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染于A549細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后24 h，用細(xì)胞裂解液充分裂解293T細(xì)胞及A549細(xì)胞，Bradford法測(cè)定裂解物總蛋白濃度。取40 μg裂解物蛋白與4×上樣緩沖液混合，100℃煮沸5 min。采用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠，按80 V 30 min、120 V 60 min先后進(jìn)行電泳;蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。4℃孵育一抗過夜，PBST按10 min/次洗滌3次;室溫孵育二抗2 h，PBST按10 min/次洗滌3次。進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，暗室X片曝光顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1 pSG5-NS1-Flag載體的酶切及序列鑒定結(jié)果擴(kuò)增后具有Flag標(biāo)簽的NS1全長(zhǎng)基因片段大小為1 089 bp(見插頁(yè)Ⅰ圖1)，與預(yù)期目的片段大小相符。載體和目的基因NS1都含1個(gè)ECORⅠ位點(diǎn)單酶切片段大小分別為463、4 722 bp，NS1擴(kuò)增片段和pSG5質(zhì)粒的雙酶切片段大小分別為1 089、4 100 bp; 6個(gè)陽(yáng)性克隆中，5、6號(hào)克隆酶切片段符合預(yù)期大小，見插頁(yè)Ⅰ圖2。5、6號(hào)克隆酶切片段經(jīng)序列鑒定證實(shí)，NS1插入片段與GenBank中的序列( U87411.1)完全吻合。

2.2 NS1蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)轉(zhuǎn)染空載體的293T細(xì)胞中NS1融合蛋白表達(dá)極低，而轉(zhuǎn)染了0.1、0.2、0.3 μg重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞中均有NS1融合蛋白顯著表達(dá)。見插頁(yè)Ⅰ圖3。

2.3 NS1蛋白在A549細(xì)胞中的表達(dá)轉(zhuǎn)染空載體的A549細(xì)胞中NS1融合蛋白表達(dá)極低，而轉(zhuǎn)染了0.2、0.3、0.4 μg真核表達(dá)載體的A549細(xì)胞中均有NS1融合蛋白表達(dá)，其中轉(zhuǎn)染0.3 μg真核表達(dá)載體的NS1融合蛋白表達(dá)條帶信號(hào)最強(qiáng)。見插頁(yè)Ⅰ圖4。

3　討論

由于目前缺乏有效的防控措施，且臨床上仍沒有研發(fā)出安全有效的疫苗和治療方法，DENV感染已成為全球性的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題［6］。文獻(xiàn)報(bào)道，NS1蛋白是DENV的一種重要非結(jié)構(gòu)蛋白，具有高度保守的特點(diǎn)。NS1蛋白的同源二聚體與膜系統(tǒng)結(jié)合［7］，可能參與病毒基因組復(fù)制;其同源六聚體以可溶性形式分泌于胞外，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體［8，9］。但是關(guān)于NS1蛋白在DENV感染中的具體作用機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究。

Flag蛋白是最常用的標(biāo)簽蛋白之一，通過將目的基因與Flag蛋白基因融合后作為融合蛋白而表達(dá)。本研究以DENV2感染THP1細(xì)胞的cDNA為模板，采用RT-PCR法擴(kuò)增具有Flag標(biāo)簽的NS1全長(zhǎng)基因，并將其克隆至pSG5質(zhì)粒中，成功構(gòu)建pSG5-NS1-Flag真核表達(dá)載體［10］，并通過酶切及DNA測(cè)序分析證實(shí)其正確性。因?yàn)?93T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率高，常被用作研究蛋白相互作用的一種工具細(xì)胞;而A549細(xì)胞作為DENV敏感的真核靶細(xì)胞，也具備較高的轉(zhuǎn)染效率。本研究選擇了這兩種細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體后NS1融合蛋白表達(dá)極低，而轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體后均有NS1融合蛋白表達(dá)，驗(yàn)證了載體表達(dá)的正確性。

對(duì)病毒蛋白的蛋白質(zhì)翻譯后修飾是目前國(guó)際上熱門的研究方向，如SUMO化修飾就是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾［11］。近年來(lái)，越來(lái)越多的病毒蛋白被證實(shí)為SUMO化修飾的底物蛋白［12］，且SUMO化修飾通過不同的機(jī)制來(lái)影響病毒復(fù)制［13］?；赟UMO化修飾在病毒和宿主細(xì)胞相互作用中的重要性，因此對(duì)DENV蛋白SUMO化修飾的深入研究是極其有意義的［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)量的增加，293T細(xì)胞中均有NS1融合蛋白顯著表達(dá)，因此可以選擇最小質(zhì)量0.1 μg進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn); 而A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染0.3 μg真核表達(dá)載體的NS1融合蛋白表達(dá)條帶信號(hào)最強(qiáng)，可以選擇該質(zhì)量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了pSG5-NS1-Flag真核表達(dá)載體，為后續(xù)研究與NS1相互作用的免疫調(diào)控蛋白［15］、NS1蛋白的蛋白質(zhì)翻譯后修飾以及闡明機(jī)體免疫系統(tǒng)抵御DENV感染的具體作用機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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收稿日期:( 2015-06-15)

通信作者簡(jiǎn)介:羅春華( 1972-)，男，主任技師、碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榕R床實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)。E-mail: lchlgj2004@ aliyun.com

作者簡(jiǎn)介:第一何莉( 1988-)，女，技師，主要從事抗感染免疫的臨床工作。E-mail: helishelly@163.com

基金項(xiàng)目:湖北省教育廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( D20131308)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015) 32-0008-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R373.33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.003