王正彪，武怡，張靜( 徐州醫(yī)學院，江蘇徐州000;徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

哮喘及呼吸道合胞病毒感染小鼠肺組織NGF、LIF表達及地塞米松對其的影響

王正彪1，武怡2，張靜1
( 1徐州醫(yī)學院，江蘇徐州221000;2徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

摘要:目的觀察支氣管哮喘及呼吸道合胞病毒( RSV)感染小鼠肺組織中神經(jīng)生長因子( NGF)、白血病抑制因子( LIF)的表達，探討地塞米松對其表達的影響。方法將100只小鼠隨機分為5組各20只，哮喘組制作哮喘模型，感染組制作RSV感染模型，合并組和地米組均制作哮喘合并RSV感染模型，地米組于造模第21～25天腹腔注射地塞米松，對照組腹腔注射并霧化吸入等量生理鹽水。造模第26天處死小鼠，HE染色觀察肺組織病理變化，RT-PCR法及免疫組化法分別檢測肺組織NGF、LIF mRNA及蛋白相對表達量。結果哮喘組支氣管、毛細支氣管及伴行血管壁周圍有大量嗜酸性粒細胞及單核細胞等炎癥細胞浸潤，支氣管黏膜增厚，血管擴張，血管平滑肌增生肥厚;感染組支氣管管腔狹窄甚至閉塞，肺泡上皮腫脹，肺泡間隔增寬，間質(zhì)性水腫;合并組兼具哮喘組、感染組的表現(xiàn);地米組無明顯炎癥細胞浸潤及間質(zhì)性改變;對照組肺組織結構清晰，基本無炎癥細胞浸潤。各組NGF、LIF mRNA及蛋白相對表達量比較，地米組、對照組均低于合并組、哮喘組、感染組，合并組高于哮喘組、感染組，P均＜0.01;地米組和對照組比較，P均＞0.05。結論RSV感染小鼠肺組織NGF及LIF表達增加，合并哮喘時增加更明顯，地塞米松干預對其肺組織NGF及LIF表達均有一定的抑制作用。

關鍵詞:呼吸道合胞病毒;神經(jīng)生長因子;白血病抑制因子;哮喘;地塞米松

呼吸道合胞病毒( RSV)是嬰幼兒呼吸道感染常見的病原體之一，RSV感染可引起毛細支氣管炎并向哮喘轉(zhuǎn)化［1，2］。支氣管哮喘的基本病變?yōu)闅獾赖穆匝装Y，基本特征是氣道高反應( AHR)。有研究證實，豚鼠感染RSV后氣道反應性明顯增高［3，4］，但具體機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，氣道的感覺神經(jīng)及其營養(yǎng)因子與氣道炎癥的形成密切相關，其中神經(jīng)生長因子( NGF)及白血病抑制因子( LIF)是參與及調(diào)控氣道神經(jīng)源性炎癥的重要炎癥因子［5，6］。地塞米松是長效糖皮質(zhì)激素的一種，在哮喘的治療中應用廣泛，其作用機制主要有抗炎、抑制Th2細胞的活化和EOS脫顆粒等，但其是否可調(diào)控NGF、LIF的表達鮮見報道。2013年10月～2015年11月，我們觀察了支氣管哮喘與RSV感染小鼠肺組織NGF、LIF表達變化，探討地塞米松對其表達的影響。

1　材料與方法

1.1材料清潔級健康雌性Balb/c純系小鼠100只，6～8周齡，體質(zhì)量( 22±2) g，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。HyClone改良型RPMI 1640培養(yǎng)基及FBS均購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司，制備成RSV病毒懸液( TCID5010－6.5/mL) ;雞卵白蛋白購自美國Sigma公司; Al( OH)3干粉購自上海生物工程有限公司; TRIzol總RNA提取試劑、TIANSscript cDNA第一鏈合成試劑盒及2× TaqRCR Master Mix購自天根生物科技(北京)有限公司，NGF、LIF mRNA及GAPDH的引物由上海生物工程有限公司設計及合成; Rabbit Anti-NGF beta(免疫組化)購自武漢博士德生物工程有限公司Rabbit Anti-LIF(免疫組化)購自北京博奧森生物技術有限公司，濃縮型DAB試劑盒及兔超敏二步法檢測試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司HERAcell 150i細胞培養(yǎng)箱購自美國賽默飛世爾科技公司，DY-38型穩(wěn)流穩(wěn)壓定時電泳( PCR)儀購自江蘇分化分析儀器廠，Olympus BX51顯微照相系統(tǒng)購自日本奧林巴斯公司。

1.2造模與干預將100只小鼠隨機分為5組，各20只。哮喘組按文獻［7，8］制作哮喘模型，感染組按文獻［9，10］制作RSV感染模型，合并組及地米組參照上述兩組的方法制作哮喘合并RSV感染模型，地米組于造模第21～25天腹腔注射地塞米松0.2 mg/( kg·d) ;對照組于第1、14天腹腔注射生理鹽水0.2 mL，第21～25天給予37℃生理鹽水20 mL霧

化吸入30 min。

1.3肺組織病理學檢查飼養(yǎng)第26天，各組以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，無菌條件下分離出兩側肺組織。4%甲醛固定液固定右肺中葉和左肺上葉肺組織，制作石蠟切片。行HE染色，400倍光鏡下觀察肺組織病理改變。

1.4肺組織NGF、LIF蛋白檢測采用免疫組化法。取石蠟切片，按免疫組化試劑盒說明書進行操作，陰性對照用PBS代替。細胞質(zhì)染成棕色為陽性細胞，用圖像分析軟件測定NGF、LIF陽性部位，以平均光密度( IOD)值表示其表達量。

1.5肺組織NGF、LIF mRNA相對表達檢測采用RT-PCR法。將右肺下葉制作組織勻漿，TRIzol液提取細胞總RNA，檢測其純度及完整性，按說明書逆轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA。NGF上游引物為5'-GTCAGTGTGTGGGTTGGAGA-3'，下游引物為5'-TTCTTGTAGCCTTCCTGCTG-3'，片段長度304 bp; LIF上游引物為5'-TGCTTGCTGGGTGTATGAAC-3'，下游引物為5'-TTCTGTGGGAGCCTGAACA-3'，片段長度356 bp; GAPDH上游引物為5'-CCTTCATTGACCTCAACTACA-3'，下游引物為5'-CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'，片段長度215 bp。反應條件: 94℃預變性3 min，94℃變性45 s，58.8℃( NGF)/57℃( LIF)/60℃( GAPDH)退火45 s，72℃延伸2 min 共35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠上電泳。凝膠成像分析系統(tǒng)測定目的基因與內(nèi)參基因灰度值的比值，以此表示目的基因相對表達量。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，方差齊時多組間比較用單因素方差分析( One-way ANOVA)檢驗，方差不齊時多組間比較用Dunnett T3檢驗，組間多重比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組肺組織病理學改變哮喘組支氣管、毛細支氣管及伴行血管壁周圍有大量嗜酸性粒細胞及單核細胞等炎癥細胞浸潤，支氣管黏膜增厚，血管擴張，血管平滑肌增生肥厚;感染組支氣管管腔狹窄甚至閉塞，肺泡上皮腫脹，肺泡間隔增寬，間質(zhì)性水腫;合并組兼具哮喘組、感染組的表現(xiàn);地米組無明顯炎癥細胞浸潤及間質(zhì)性改變;對照組肺組織結構清晰基本無炎癥細胞浸潤。

2.2各組肺組織NGF、LIF mRNA及蛋白表達比較見表1。

表1　各組肺組織NGF、LIF mRNA及蛋白表達比較( n =20，珔x±s)

3　討論

氣道神經(jīng)源性炎癥學說認為，氣管及支氣管上皮可因炎癥反應受損脫落，導致感覺神經(jīng)末梢暴露并釋放活性物質(zhì);這些遞質(zhì)可反作用于外周靶細胞引起神經(jīng)營養(yǎng)因子升高［11］。NGF可由外周靶細胞合成，經(jīng)軸突攝取后逆行轉(zhuǎn)運至背根神經(jīng)節(jié)細胞，具有促進神經(jīng)細胞生長、存活和分化的作用，能增強神經(jīng)突觸的可塑性，從而刺激神經(jīng)遞質(zhì)分泌增加［12］; NGF還具有非神經(jīng)元細胞的生物活性，可參與和整合刺激自適系統(tǒng)的成熟及表達。據(jù)文獻報道，NGF 與LIF同屬神經(jīng)生長因子家族成員，有相似的生物學活性［13］;二者均作為胞外刺激因子作用于效應細胞過程中，具有相同的信號轉(zhuǎn)導通路。當一種因子受到抑制時，另一種因子的表達水平同樣受到抑制，故二者共同參與哮喘的發(fā)病，在RSV感染后導致支氣管哮喘發(fā)生過程中起協(xié)同作用［13］。

本研究顯示，HE染色后鏡下可見，感染組以炎性表現(xiàn)為主，無典型哮喘樣病理改變;但合并組病理組織改變較哮喘組、感染組明顯加重。據(jù)此推測RSV感染后并非直接導致支氣管哮喘發(fā)生，而是在一定程度上加重哮喘病理組織損傷。另外，與對照組比較，哮喘組、感染組和合并組NGF、LIF mRNA及蛋白表達均增加，僅與地米組比較無統(tǒng)計學差異提示哮喘氣道神經(jīng)源性炎癥的發(fā)生可能與多種神經(jīng)營養(yǎng)因子共同作用有關，這些因子的作用機制相似但并非相同［14～16］;地塞米松可同時抑制這些因子表達，引起其他相關致病因子的表達障礙，在臨床治療過程中，尋找抑制神經(jīng)生長因子的抑制劑可減少

RSV感染后發(fā)生哮喘的概率。本研究為哮喘的防治提供了新思路。

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收稿日期:( 2015-02-12)

通信作者:武怡，E-mail: 2858643598@ qq.com

文章編號:1002-266X( 2015) 32-0032-03

文獻標志碼:B

中圖分類號:R-332

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.012