成永霞，孫立新，張大偉，徐彪，郭素芬，劉貴波( 牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江570;牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院)

肝臟X受體α對高糖所致心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機制

成永霞1，孫立新1，張大偉1，徐彪2，郭素芬1，劉貴波1
( 1牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江157011;2牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院)

摘要:目的觀察肝臟X受體α( LXRα)對高糖所致心肌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其機制。方法將對數(shù)生長期的H9c2大鼠心肌細(xì)胞隨機分為5組，空白組、低T0組、中T0組、高T0組分別用二甲基亞砜及5、10、20 μmol/L 的LXRα激動劑T0901317預(yù)處理12 h，高糖對照組不處理;之后低T0組、中T0組、高T0組、高糖對照組用33 mmol/L的高糖浸潤24 h。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，Western blotting法檢測細(xì)胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相對表達量。結(jié)果空白組、低T0組、中T0組、高T0組、高糖對照組細(xì)胞凋亡率分別為10.67%±0.82%、29.53%±4.21%、19.76%±2.80%、15.15%±1.90%、34.09%±5.32%;多組間比較，P＜0.05;低T0組、高糖對照組與空白組比較，P均＜0.01;中T0組、高T0組與高糖對照組比較，P均＜0.05。與空白組比較，低T0組、中T0組、高T0組、高糖對照組Bcl-2表達均降低，Bax和Caspase-3表達均增加，P均＜0.05;與中T0組、高T0組比較，高糖對照組上述指標(biāo)變化更明顯，P均＜0.05;低T0組與高糖對照組上述指標(biāo)比較，P均＞0.05。結(jié)論中、高濃度LXRα可抑制高糖所致的心肌細(xì)胞凋亡，其機制可能與降低Bax、Caspase-3表達和增加Bcl-2表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞:心肌細(xì)胞; T0901317;肝臟X受體;高血糖;細(xì)胞凋亡

糖尿病性心肌病是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥［1，2］，高血糖是其獨立危險因素［3，4］。肝臟X受體( LXRs)包括α和β兩個亞型，是由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族［5～9］。近期研究發(fā)現(xiàn)，LXRs是人體中潛在的藥理學(xué)靶受體，人工合成的LXRs激動劑被用于多種人類疾病的治療［10，11］。T0901317(以下稱T0)是一種人工合成的強效LXRα激動劑，已被證實可提高肥胖小鼠的胰島素敏感性［12］，并改善2型糖尿病患者的病情［13］，可能與其抑制磷酸腺苷活化蛋白激酶釋放而減弱高糖所致的內(nèi)皮干細(xì)胞功能障礙有關(guān)［14］;但被T0激活的LXRα是否可以阻止高糖所致的心肌細(xì)胞凋亡尚未證實。2014年1～12月，我們對上述問題進行了研究，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機制。

1　材料與方法

1.1材料H9c2大鼠心肌細(xì)胞由美國模式培養(yǎng)物保藏所提供; T0購自Cayman公司;細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司; Caspase-3一抗、Bax一抗、Bcl-2一抗均購自美國Sigma公司。

1.2細(xì)胞分組與處理H9c2細(xì)胞用杜氏培養(yǎng)液(包括5.5 mmol/L葡萄糖、10% FBS、100 U/mL盤尼西林和100 mg/mL鏈霉素)培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的細(xì)胞隨機分為5組，接種于24孔板，每孔做3個復(fù)孔，在孵育箱中于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)其中，空白組、低T0組、中T0組、高T0組分別用二甲基亞砜及5、10、20 μmol/L的T0預(yù)處理12 h，高糖對照組不處理，之后低T0組、中T0組、高T0組高糖對照組加入33 mmol/L的高糖(稱取0.8 g葡萄糖溶解在200 mL含有10% FBS、1%青鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基中)浸潤24 h。

1.3相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1細(xì)胞凋亡率采用流式細(xì)胞儀。高糖浸潤24 h后收集各組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min;吸除上清，加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞。依次加入5 μL Annexin V-FITC、Propidium Iodide混勻，室溫避光孵育15 min。上流式細(xì)胞儀，檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.2細(xì)胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達采用Western blotting法。抽提蛋白質(zhì)并定量，SDS PAGE電泳，轉(zhuǎn)印，封閉，孵育一抗、二抗，ECL底物發(fā)光;抗體剝脫，封閉，孵育內(nèi)參抗體及其二抗，ECL底物發(fā)光。將膠片進行掃描，用Gel-Pro-Analyzer軟

件分析，目標(biāo)蛋白表達量以目標(biāo)條帶光密度與β-actin光密度的比值表示。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞凋亡率比較空白組、低T0組、中T0組、高T0組、高糖對照組細(xì)胞凋亡率分別為10.67%± 0.82%、29.53%±4.21%、19.76%±2.80%、15.15%± 1.90%、34.09%±5.32%;多組間比較，P＜0.05;低T0組、高糖對照組與空白組比較，P均＜0.01;中T0組、高T0組與高糖對照組比較，P均＜0.05。

2.2各組Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達比較見表1。

表1　各組Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達比較(相對表達量，珔x±s)

3　討論

LXRα可以通過與靶基因啟動子區(qū)域的LXR反應(yīng)原件相結(jié)合而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，LXRα及其下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能涉及了糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌病大鼠LXRα基因啟動子區(qū)的甲基化顯著，進一步證明了LXRα與糖尿病心肌病的發(fā)病有關(guān)［15］。

T0是一種強選擇性LXRα激動劑，可增加血清LXRα水平［12］。本研究對心肌細(xì)胞進行T0預(yù)處理，觀察LXRα對高血糖所致心肌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖對照組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白組，說明高糖可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增加;中T0組、高T0組細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖對照組，而低T0組細(xì)胞凋亡率與高糖對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，說明10、20 μmol/L的T0可有效抵抗高糖所致的心肌細(xì)胞凋亡，而5 μmol/L的T0則沒有這種作用，可能是5 μmol/L的T0濃度太低，作用不明顯。

Bcl-2/Bax蛋白家族是線粒體細(xì)胞色素C釋放的調(diào)節(jié)蛋白。Bcl-2是抗凋亡蛋白，可阻止細(xì)胞色素C的釋放，維持線粒體膜對蛋白質(zhì)的不通透性; Bax則能夠誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，加速細(xì)胞凋亡。本研究中，單獨經(jīng)高糖處理的心肌細(xì)胞Caspase-3、Bax表達增加，Bcl-2表達減少;而經(jīng)10、20 μmol/L的T0預(yù)處理后的心肌細(xì)胞Bax、Caspase-3表達降低，Bcl 2表達增加，5 μmol/L的T0則沒有這種作用。因此，被中、高濃度T0激活的LXRα可抑制高糖所致的心肌細(xì)胞凋亡，該作用與其降低Bax、Caspase-3表達和增加Bcl-2表達有關(guān)，提示T0具有防治糖尿病性心肌病的潛在藥理學(xué)作用。

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收稿日期:( 2015-02-28)

通信作者:劉貴波，E-mail: lgb20073@163.com

基金項目:牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項目( ZS201311)。

文章編號:1002-266X( 2015) 32-0028-02

文獻標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R36

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.010