蘇強(qiáng)，馬妮娜，李琴，俞靜，張晨光(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京100050)

丁酸鈉聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢透明細(xì)胞癌ES-2細(xì)胞活性及增殖的影響

蘇強(qiáng)，馬妮娜，李琴，俞靜，張晨光
(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京100050)

摘要:目的觀察丁酸鈉聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢透明細(xì)胞癌ES-2細(xì)胞活性及增殖的影響。方法將對(duì)數(shù)生長期的卵巢透明細(xì)胞癌ES-2細(xì)胞隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組。觀察組分別加入1、2、4、6 mmol/L的丁酸鈉和5 μg/mL順鉑，對(duì)照組分別加入與觀察組相同濃度的丁酸鈉。采用MMT法檢測(cè)兩組細(xì)胞活性，Western blotting法檢測(cè)兩組凋亡蛋白( c-PAPP、c-Caspase-3)和增殖蛋白( ERK、p-ERK)相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果觀察組加入1、2、4、6 mmol/L丁酸鈉和順鉑細(xì)胞活性分別為51%±3%、39%±2%、22%±2%、11%±1%，多組間及組內(nèi)兩兩比較，P均＜0.05;對(duì)照組加入1、2、4、6 mmol/L丁酸鈉細(xì)胞活性分別為88%±4%、76%±3%、69%±2%、54%±2%，多組間及組內(nèi)兩兩比較，P均＜0.05;兩組加入相同濃度丁酸鈉細(xì)胞活性比較，P均＜0.05。隨著丁酸鈉濃度增加，兩組凋亡蛋白c-PAPP、c-Caspase-3相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，增殖蛋白ERK、p-ERK相對(duì)表達(dá)量逐漸降低。與對(duì)照組同濃度丁酸鈉比較，觀察組1、2、4、6 mmol/L丁酸鈉和順鉑c-PAPP、c-Caspase-3蛋白表達(dá)均升高，1、6 mmol/L丁酸鈉和順鉑ERK、p-ERK蛋白表達(dá)均降低;兩組比較，P均＜0.05。結(jié)論丁酸鈉聯(lián)合順鉑可降低卵巢透明細(xì)胞癌ES-2細(xì)胞活性，抑制其增殖、促進(jìn)其凋亡;丁酸鈉濃度越高，上述作用越明顯。

關(guān)鍵詞:卵巢腫瘤;卵巢透明細(xì)胞癌;丁酸鈉;順鉑;細(xì)胞活性;增殖蛋白;凋亡蛋白

Effect of sodium butyrate combined with cisplatin on cell viability and proliferation of ovarian clear cell carcinoma ES-2 cells

SU Qiang，MA Ni-na，LI Qin，YU Jing，ZHANG Chen-guang
( Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100050，China)

Abstract:Objective To observe the effect of sodium butyrate combined with cisplatin on cell viability and proliferation of ovarian clear cell carcinoma ES-2 cells.Methods The ovarian clear cell carcinoma ES-2 cells in the logarithmic phase were randomly divided into the observation groups and control groups.The observation groups were added 1，2，4 and 6 mmol/L sodium butyrate ( NaB) and 5 μg/mL cisplatin.The control groups were added the same concentrations of NaB.The cell activities were detected by MMT，and the relative expression levels of c-PAPP，c-Caspase-3，ERK and p-ERK were detected by Western blotting.Results The cell viabilities of the observation groups which were treated with 1，2，4，6 mmol/L NaB and 5 μg/mL cisplatin were 51%±3%，39%±2%，22%±2% and 11%±1%，respectively; and significant difference was found between groups ( all P＜0.05).The cell viabilities of the control groups were 88%± 4%，76%±3%，69%±2% and 54%±2%，respectively; and significant difference was found between groups ( all P＜0.05).Meanwhile，significant difference was found in the cell viability between the two groups which were added with the same concentrations of NaB ( all P＜0.05).With the increased concentrations of NaB，the relative expression levels of c-PAPP and c-Caspase-3 in the two kinds of groups were gradually increased，and the levels of ERK and p-ERK were significantly decreased.Compared with the control groups，the relative expression levels of c-PAPP and c-Caspase-3 in the observation groups which were added 1，2，4 and 6 mmol/L NaB and 5 μg/mL cisplatin were all increased and the levels of ERK and P-ERK were decreased in the observation groups which were added 1 and 6 mmol/L NaB and 5 μg/mL cisplatin.Significant difference was found between the two kinds of groups ( all P＜0.05).Conclusion NaB combined with cispla-

tin may decrease the cell viability of ovarian clear cell carcinoma ES-2 cells，inhibit the proliferation and promote the apoptosis.The effect can be stronger with the higher concentrations of NaB.

Key words:ovarian neoplasms; ovarian clear cell carcinoma; sodium butyrate; cisplatin; cell viability; proliferin; apoptin

卵巢透明細(xì)胞癌發(fā)病率呈逐漸升高趨勢(shì)，其術(shù)后復(fù)發(fā)率高，對(duì)鉑類化療藥物不敏感;化療耐藥是影響患者預(yù)后的主要因素;增強(qiáng)患者的順鉑化療敏感性是近年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。丁酸鈉( NaB)是組蛋白去乙酰化酶抑制劑，可通過抑制組蛋白去乙酰化酶松弛染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并抑制其生長［1］，但其是否可增加卵巢透明細(xì)胞癌患者對(duì)順鉑化療的敏感性鮮見報(bào)道。2014年8～12月，我們觀察了NaB聯(lián)合5 μg/mL順鉑對(duì)卵巢透明細(xì)胞癌ES-2細(xì)胞活性及增殖的影響。

1　材料與方法

1.1材料人卵巢透明細(xì)胞癌ES-2細(xì)胞由首都醫(yī)科大學(xué)附屬遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。順鉑購自山東齊魯制藥有限公司，NaB、ERK、P-ERK、Caspase-3、PARP一抗、二抗均購自美國Sigma-Aldrich公司。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購于美國BioTek公司，全套聚丙烯酰胺電泳設(shè)備購于美國Bio-Rad公司，自動(dòng)洗片機(jī)購于美國ALL PRO公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理將人卵巢透明細(xì)胞癌ES-2細(xì)胞置于含10% FBS及青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d傳代1次。將對(duì)數(shù)生長期的人卵巢癌ES-2細(xì)胞隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，按每孔1×104個(gè)接種至96孔板中，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加入100 μL的培養(yǎng)液后，觀察組分別加入1、2、4、6 mmol/L的NaB和5 μg/mL順鉑，對(duì)照組分別加入1、2、4、6 mmol/L的NaB。

1.3相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1細(xì)胞活性采用MTT法。兩組置于37℃、5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，同時(shí)以加入二甲基亞砜( DMSO)的細(xì)胞作為對(duì)照。吸棄培養(yǎng)基后PBS沖洗3次，加入完全培養(yǎng)基100 μL。各孔加入MTT溶液10 μL，37℃孵育2 h，脫色搖床振蕩10 min。于酶標(biāo)儀上測(cè)定波長570 nm處各孔吸光度( OD值)，細(xì)胞活性= ( OD細(xì)胞－OD對(duì)照)/OD對(duì)照×100%。

1.3.2細(xì)胞凋亡蛋白( c-PAPP、c-Caspase-3)及增殖蛋白( ERK、p-ERK)表達(dá)采用Western blotting法。收集兩組培養(yǎng)72 h后的細(xì)胞，接種至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液后用冰冷PBS沖洗2次。細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，裂解液重懸細(xì)胞，12 000 r/min離心30 min，取上清，于－80℃保存。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，聚丙烯酸胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉。分別加入一抗室溫孵育2 h，加入二抗室溫孵育45 min。以O(shè)dyssey熒光掃描儀掃描顯影，Quantity one軟件計(jì)算灰度比值以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件計(jì)算凋亡蛋白( c-PAPP、c-Caspase-3)及增殖蛋白( ERK、p-ERK)的相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，多組間比較采用秩和檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組細(xì)胞活性比較觀察組加入1、2、4、6 mmol/L NaB和順鉑的細(xì)胞活性分別為51%±3% 39%±2%、22%±2%、11%±1%，多組間及組內(nèi)兩兩比較，P均＜0.05;對(duì)照組加入1、2、4、6 mmol/L NaB細(xì)胞活性分別為88%±4%、76%±3%、69% ±2%、54%±2%，多組間及組內(nèi)兩兩比較，P均＜0.05;兩組相同濃度NaB細(xì)胞活性比較，P均＜0.05。

2.2兩組凋亡蛋白及增殖蛋白表達(dá)比較隨著NaB濃度的增加，兩組凋亡蛋白c-PAPP、c-Caspase 3相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，增殖蛋白ERK、p-ERK相對(duì)表達(dá)量逐漸降低。兩組凋亡蛋白及增殖蛋白表達(dá)比較見表1。

3　討論

卵巢透明細(xì)胞癌臨床少見，惡性程度極高，占卵巢惡性腫瘤的5%～13%［2］。鉑類是臨床上治療卵巢惡性腫瘤最常用的化療藥物，順鉑主要作用于DNA鏈間及鏈內(nèi)絞鏈，形成DDP-DNA復(fù)合物而干擾DNA復(fù)制;或與核蛋白及胞漿蛋白結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞生長而導(dǎo)致其死亡。但卵巢透明細(xì)胞癌對(duì)于鉑類化療不敏感［3］。研究表明，卵巢上皮性癌的化療有效率(含鉑類)為73%～81%，而卵巢透明細(xì)胞癌的一線化療有效率(含鉑類)為11%～27%［4～6］;對(duì)于復(fù)發(fā)的卵巢透明細(xì)胞癌，二線化療有效率(含鉑類)＜10%［7，8］。因此，如何增強(qiáng)卵巢透明細(xì)胞癌對(duì)于順鉑的化療敏感性成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

表1　兩組凋亡蛋白c-PAPP、c-Caspase-3及增殖蛋白ERK、p-ERK表達(dá)比較(相對(duì)表達(dá)量，珔x±s)

研究表明，腫瘤發(fā)生與組蛋白N端賴氨酸殘基的乙?；腿ヒ阴；^程失衡密切相關(guān)，其中組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；? HDAC)共同控制著組蛋白的乙?；剑瑑烧叩膭?dòng)態(tài)平衡控制著染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)，其動(dòng)態(tài)失衡與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)［9，10］。組蛋白去乙?；敢种苿? HDACI)可通過促進(jìn)組蛋白的乙?；约按龠M(jìn)非組蛋白底物的乙?；l(fā)揮抗癌活性;其基因轉(zhuǎn)錄異常可阻滯細(xì)胞周期，抑制DNA修復(fù)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11］。有研究表明，HDACI與一些傳統(tǒng)化療藥物共同應(yīng)用可能會(huì)降低化療藥物介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡的閾值，具有協(xié)同抗腫瘤作用［12，13］。NaB屬于HDACI的短鏈脂肪酸鹽，可通過抑制HDAC松弛染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)抑癌基因表達(dá)，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用［14］。

前期研究顯示，5 μg/mL的順鉑作用于卵巢透明細(xì)胞癌ES-2細(xì)胞后，其細(xì)胞活度約為50%，因此本實(shí)驗(yàn)選擇此濃度進(jìn)行研究。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組加入相同濃度NaB比較，觀察組細(xì)胞活性和凋亡蛋白c-PAPP、c-Caspase-3相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，增殖蛋白ERK、p-ERK相對(duì)表達(dá)量均顯著降低;說明NaB聯(lián)合順鉑可降低卵巢透明細(xì)胞癌ES-2細(xì)胞活性，并抑制其增殖、促進(jìn)其凋亡;且觀察組上述指標(biāo)變化隨NaB濃度的增加而變化更明顯，說明其具有一定的濃度依賴性。本實(shí)驗(yàn)屬于細(xì)胞水平的初步研究，NaB聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢透明細(xì)胞癌ES-2細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制仍需要進(jìn)一步的動(dòng)物、分子甚至臨床水平的深入研究。

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收稿日期:( 2015-06-13)

通信作者簡(jiǎn)介:張晨光( 1980-)，男，高級(jí)講師，研究方向?yàn)閷?shí)體惡性腫瘤的基礎(chǔ)。E-mail: chzhang@ ccmu.edu.cn

作者簡(jiǎn)介:第一蘇強(qiáng)( 1978-)，男，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)閷?shí)體惡性腫瘤的臨床與基礎(chǔ)。E-mail: BJSQ1978@163.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目( 81201816) ;首都醫(yī)科大學(xué)臨床基礎(chǔ)合作研究基金資助項(xiàng)目( 15JL33) ;首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院院?jiǎn)?dòng)基金資助項(xiàng)目( yyqdkt2014-12)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015) 32-0017-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R737.31

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.006