李靜，龔成，曾鋒( 麻城市人民醫(yī)院，湖北麻城438300;湖北省中南醫(yī)院)

單核細胞趨化蛋白-1對人卵巢癌CaOV3細胞黏附、侵襲能力的影響及其機制

李靜1，龔成2，曾鋒1
( 1麻城市人民醫(yī)院，湖北麻城438300;2湖北省中南醫(yī)院)

摘要:目的探討單核細胞趨化蛋白-1( MCP-1)對人卵巢癌CaOV3細胞黏附、侵襲能力的影響及其機制。方法將對數(shù)生長期的人卵巢癌CaOV3細胞隨機分為觀察組和對照組，觀察組經(jīng)MCP-1( 20 μg/mL)預(yù)處理，對照組不予處理。兩組行體外黏附試驗，記錄黏附Fibronectin、Collagen及Laminin蛋白的細胞數(shù);行體內(nèi)黏附試驗，記錄黏附的細胞球體數(shù)目、體積及部位;行細胞侵襲試驗，記錄穿膜細胞數(shù)。采用Western blotting法檢測兩組上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(上皮指標E-cadherin，間質(zhì)指標Vimentin、N-cadherin)的表達。結(jié)果觀察組黏附Fibronectin、Collagen 及Laminin蛋白的細胞數(shù)及穿膜細胞數(shù)均高于對照組，P均＜0.01。兩組腫瘤細胞以細胞球體形式黏附在小鼠大網(wǎng)膜脂肪細胞部位，并且觀察組黏附的細胞球體數(shù)目更多、球體更大。觀察組E-cadherin低于對照組，Vimentin、N-cadherin均高于對照組，P均＜0.01。結(jié)論MCP-1可提高人卵巢癌CaOV3細胞的黏附、侵襲能力，可能與其促進上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。

關(guān)鍵詞:卵巢癌;單核細胞趨化蛋白-1;黏附;侵襲;上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化

卵巢癌不同于其他實體瘤，其侵襲轉(zhuǎn)移方式主要局限在腹腔內(nèi)部而很少發(fā)生血液轉(zhuǎn)移［1～4］。腹腔黏附是腹腔播散的第一步，單個腫瘤細胞或腫瘤球體黏附在體腔器官的系膜細胞表面，進一步種植發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，從而形成轉(zhuǎn)移灶［5］。單核細胞趨化蛋白-1( MCP-1)主要由單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等釋放，對單核細胞具有趨化活性，并可以激活單核細胞和腫瘤相關(guān)巨噬細胞［6］。研究表明，卵巢癌患者癌組織及腹水中MCP-1水平升高，且MCP-1高表達的卵巢癌患者生存期低于低表達者［7～9］。目前，MCP-1表達升高是否與卵巢癌的腹腔播散有關(guān)尚不明確。2013年11月～2014年6月，我們觀察了MCP-1對人卵巢癌CaOV3細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力及上皮細胞間質(zhì)化的影響，以期為了解卵巢癌腹腔播散機制并遏制其播散提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料人卵巢癌CaOV3細胞購自美國標準生物品收藏中心( ATCC)。BALB/c-nu小鼠6只，體質(zhì)量16～20 g，購于北京華阜康公司。McCoy's 5A培養(yǎng)基及FBS購自美國Gibco公司，MCP-1蛋白及ELISA檢測試劑盒均購于美國R＆D公司，E-cadher in、N-cadherin、Vimentine及GAPDH兔單抗均購自美國Epitomics公司，細胞染料PKH-67購于美國Sigma公司，Transwell小室購于美國Corning公司Matrigel購于美國BD公司，免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋公司。

1.2細胞培養(yǎng)及分組將CaOV3細胞置于含10% FBS的McCoy's 5A培養(yǎng)液(含青霉素100 U/mL及鏈霉素100 μg/mL)中，于37℃、5% CO2條件下傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞隨機分為觀察組和對照組。

1.3 MCP-1對CaOV3細胞黏附能力影響的觀察

1.3.1體外黏附試驗觀察組經(jīng)MCP-1( 20 μg/mL)預(yù)處理12 h，對照組不予處理。將兩組細胞按1×104/孔接種于備用的96孔板，每孔設(shè)6個復(fù)孔。包被Fibronectin 10 μg/mL、Collagen I 10 μg/mL、Laminin 5 μg/mL于4℃過夜，PBS洗凈后，用1%牛血清白蛋白于37℃條件下封閉1 h。30 min后吸棄上清，PBS吹打掉未黏附細胞，100倍光鏡下隨機選取5個視野，計算黏附細胞數(shù)，取其平均值。

1.3.2體內(nèi)黏附試驗將CaOV3細胞用PKH-67染料染色，觀察組經(jīng)MCP-1( 20 μg/mL)預(yù)處理12 h，對照組不予處理。取1×106個細胞重懸在100 μL PBS中，分別注入小鼠(每組3只)腹腔。4 h后處死小鼠，洗凈腹腔未黏附細胞。在熒光顯微鏡下觀察兩組胃大彎下部大網(wǎng)膜組織，于40倍光鏡下隨機選取3個視野，觀察大網(wǎng)膜處黏附的腫瘤細胞球體數(shù)量和體積。

1.4 MCP-1對CaOV3細胞侵襲能力影響的觀察兩組行細胞侵襲試驗。Transwell上室每孔加入50 μL的Matrigel( McCoy's 5A培養(yǎng)液按1∶5稀釋)，37℃放置1 h。觀察組經(jīng)MCP-1( 20 μg/mL)預(yù)處理12 h，對照組不予處理。凝固后上室加入1×104的兩組細胞(均經(jīng)100 μL無血清培養(yǎng)基重懸)，下室加入600 μL含30% FBS的McCoy's 5A培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。取出小室，用棉簽拭去膜上層細胞，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗凈后風(fēng)干。高倍鏡下選取5個不同視野，計算穿膜細胞數(shù)。

1.5 MCP-1對CaOV3細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標表達影響的觀察采用Western blotting法。觀察組經(jīng)MCP-1( 20 μg/mL)預(yù)處理24 h，對照組不予處理。胰酶消化后，PBS洗滌。RiPA蛋白裂解液提取收集細胞蛋白，每孔50 μg上樣量進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5% BSA封閉1 h，加入一抗( E-cadherin 1∶500，N-cadherin 1∶1 000，Vimentin 1∶1 000，GAPDH 1∶1 000)，4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入HRP標記的二抗( 1∶3 000)，室溫孵育1 h。TBST充分洗掉背景后，增強ECL底物曝光。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件計算條帶灰度值，蛋白相對表達量以目的蛋白和GAPDH的灰度比值表示。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組細胞黏附、侵襲能力比較體外黏附試驗結(jié)果顯示，觀察組與對照組黏附Fibtonectin蛋白的細胞數(shù)分別為( 424±25)、( 216±13)個，黏附Colla gen蛋白的細胞數(shù)分別為( 261±16)、( 126±9)個黏附Laminin蛋白的細胞數(shù)分別為( 326±35)、( 176 ±23)個;兩組比較，P均＜0.01。體內(nèi)黏附試驗結(jié)果顯示，腫瘤細胞以細胞球體形式黏附在小鼠大網(wǎng)膜脂肪細胞部位，觀察組黏附的球體細胞數(shù)目為( 2.2±0.4)個，對照組為( 0.8±0.3)個，并且觀察組黏附的球體更大。觀察組穿膜細胞數(shù)為( 235± 12)個，對照組為( 126±8)個;兩組比較，P＜0.01。

2.2兩組上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標表達比較見表1。

表1　兩組上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標表達比較(相對表達量，珔x±s)

3　討論

卵巢癌病死率居婦科惡性腫瘤之首，確診時絕大多數(shù)處于疾病中晚期。廣泛的腹腔播散病灶和大量腹水是卵巢癌進展期的主要臨床特征，以手術(shù)為主的綜合治療雖可延長患者的生存期，但絕大多數(shù)卵巢癌患者術(shù)后兩年內(nèi)會復(fù)發(fā)。卵巢癌細胞腹腔黏附是腹腔侵襲轉(zhuǎn)移的第一步［11］，卵巢癌患者腹腔微環(huán)境中大量的免疫細胞包括巨噬細胞、腫瘤相關(guān)成纖維細胞、系膜細胞以及腫瘤細胞等相互作用，可能與促進腫瘤細胞抵抗失巢凋亡，并獲得更強的惡性潛能有關(guān)［12］。因此，腹腔播散病灶可能是卵巢癌患者預(yù)后不良的主要原因。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程指的是腫瘤細胞在疾病進展過程中失去上皮標志如E-cadherin，而獲得N-cad herin、Vimentin等間質(zhì)侵襲表型標志。卵巢癌細胞失去E-cadherin表達后，細胞之間連接減弱，侵襲細胞外基質(zhì)能力增強，從而加速了卵巢癌的播散進程研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者癌細胞E-cadherin低表達是預(yù)后不良的標志［13］。因此，觀察卵巢癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化具有重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1可促進乳腺癌細胞的肺轉(zhuǎn)移并可以促進頭頸部腫瘤的進展［14，15］。我們在體內(nèi)外分別進行了MCP-1對卵巢癌CaOV3細胞黏附能

力影響的觀察。體外黏附試驗結(jié)果表明，MCP-1預(yù)處理后，CaOV3細胞對細胞外基質(zhì)Fibronectin、Collagen以及Laminin的黏附能力顯著增加。體內(nèi)黏附試驗結(jié)果表明，MCP-1預(yù)處理后，小鼠大網(wǎng)膜處黏附的腫瘤細胞數(shù)量更多，球體更大。以上均表明，MCP-1可以促進腫瘤細胞獲得更大的體內(nèi)外黏附能力，從而加速腹腔播散過程。同時，MCP-1預(yù)處理卵巢癌CaOV3細胞的穿膜細胞數(shù)顯著增多，間質(zhì)指標Vimentin、N-cadherin均顯著升高，上皮性指標E-cadherin則顯著降低。這些結(jié)果表明卵巢癌微環(huán)境中的MCP-1能夠提高腫瘤細胞的黏附、侵襲能力，并可能與其促進上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。但是關(guān)于MCP-1對卵巢癌細胞的調(diào)控機制仍需進一步探討。

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收稿日期:( 2014-11-10)

通信作者:曾鋒，E-mail: 402892550@ qq.com

文章編號:1002-266X( 2015) 32-0025-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R737.31

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.009