沈大川，董斌，溫超

(1鐵嶺市中心醫(yī)院，遼寧鐵嶺112001；2大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院)

丙泊酚對腦缺血再灌注大鼠腦組織Homer-1a表達的影響及其機制

沈大川1，董斌2，溫超2

(1鐵嶺市中心醫(yī)院，遼寧鐵嶺112001；2大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院)

目的 觀察丙泊酚對腦缺血再灌注大鼠腦組織Homer-1a表達的影響，并探討其機制。方法 雄性SD大鼠120只，隨機分為假手術組、造模組、丙泊酚組，每組40只。模型組、丙泊酚組線栓法建立腦缺血再灌注模型，假手術組僅行血管分離處理不插入線栓；造模后30 min，丙泊酚組腹腔注射丙泊酚10 mg/100 g，假手術組和對照組均腹腔注射等體積生理鹽水。給藥處理3 h、24 h、72 h、7 d分別進行神經功能評分，采用Real-time PCR法檢測腦組織Homer-1a mRNA，應用酶聯免疫吸附法檢測血清S-100β。結果 與假手術組比較，模型組和丙泊酚組4個時間點神經功能評分、血清S-100β水平均增加(P均<0.05)，以模型組增高更顯著(P均<0.05)。與假手術組相比，模型組在3、24 h時間點腦組織Homer-1a mRNA降低(P均<0.05)；丙泊酚組4個時間點腦組織Homer-1a mRNA均較其他兩組升高(P均<0.05)。在所有大鼠樣本中，腦組織Homer-1a mRNA表達與血清S-100β呈負相關(r=-0.939，P<0.01)。結論 丙泊酚麻醉可通過誘導腦組織Homer-1a mRNA表達發(fā)揮對腦缺血再灌注大鼠的腦保護作用，該作用可能與其降低血清S-100β水平有關。

缺血再灌注損傷；腦組織；丙泊酚；Homer-1a基因；S-100β；大鼠

研究發(fā)現，麻醉藥通過擴張腦血管、降低腦組織代謝、抑制自由基合成、減緩脂質過氧化反應、調控神經遞質等不同途徑，發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷的作用[1～3]。丙泊酚作為一種新型靜脈麻醉藥，具有起效快、輸注后無蓄積、蘇醒迅速而完全、不良反應少等特點，已廣泛應用于臨床。研究發(fā)現，丙泊酚具有一定的腦保護作用[4,5]，但其作用機制尚未完全闡明。Homer蛋白屬于突觸后密度蛋白質家族，其中Homer-1a是該家族中第1個被確認的蛋白，經神經元興奮、突觸形成或重塑性增加等神經活動誘導而快速短暫表達[6,7]。已有研究表明，Homer蛋白可抑制缺血后神經細胞損傷[8]。2013年9月～2014年5月，本研究觀察丙泊酚對腦缺血再灌注大鼠腦組織Homer-1a表達的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠120只，體質量200～250 g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理方法 按隨機數字法將大鼠分為假手術組、模型組、丙泊酚組，每組40只。模型組、丙泊酚組大鼠術前禁食過夜，應用2%戊巴比妥鈉按40 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉。手術分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，于頸總動脈分叉處下方1 mm處向頸內動脈方向插入直徑0.25 mm的線栓，插入長度約18 mm。線栓插入過程中有阻力感，并且大鼠出現呼吸頻率及心率加快、尿失禁等表現，可認定出現腦缺血。缺血1 h后拔出線栓，恢復大腦中動脈血供，即再灌注。假手術組僅進行血管分離處理，不插入線栓。造模后30 min，丙泊酚組腹腔注射丙泊酚10 mg/100 g(Sigma-Aldrich)，假手術組和模型組均腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.2 神經功能評分 分別于藥物處理3 h、24 h、72 h、7 d參照Zea Longa等[9]方法對各組大鼠進行神經功能評分：無明顯異常表現計0分，左側Honer征計1分，左側前爪不能完全伸直計2分，向左側轉圈計3分，向左側傾倒計4分，死亡計5分。

1.2.3 血清S-100β檢測 分別于藥物處理3 h、24 h、72 h、7 d眼眶靜脈毛細管取血2 mL，分離血清，-80 ℃冰凍保存，1周內檢測。采用S-100β酶聯免疫檢測試劑盒(上海拜力生物科技有限公司)檢測血清S-100β水平，操作步驟按說明書進行。

1.2.4 腦組織Homer-1a mRNA檢測 分別于藥物處理3 h、24 h、72 h、7 d斷頭法急性處死各組大鼠，開顱后切取術側水腫腦組織，-80 ℃冰凍保存，1周內檢測。應用TRIzol試劑(Invitrogen)提取腦組織總RNA；應用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)ver 3.0試劑盒(大連寶生物工程有限公司)對RNA樣本進行逆轉錄獲得cDNA；參照試劑盒說明書進行Real-time PCR擴增。Homer-1a上游引物5′-CAAACACTGTTTATGGACTG-3′、下游引物5′-TGCTGAATTGAA-TGTGTACC-3′，β-actin上游引物5′-GCAGAAGGAG-ATCACTGCCCT-3′、下游引物5′-GCTGATCCACATC-TGCTGGAA-3′。反應條件為：95 ℃，5 min；95 ℃、30 s，60 ℃、45 s，72 ℃、20 s，40個循環(huán)。實驗至少重復3次，采用2-ΔΔCT法對腦組織Homer-1a mRNA進行統計分析。

2 結果

腦缺血再灌注大鼠模型建立過程中，8只大鼠死亡，將剩余72只造模成功大鼠隨機分入模型組和丙泊酚組，每組36只，每個時間點取9只進行實驗。假手術組40只大鼠全部存活，每個時間點取10只進行實驗。

2.1 各組神經功能評分比較 見表1。

注：與假手術組同時點比較，*P<0.05；與模型組同時點比較，#P<0.05。

2.2 各組血清S-100β比較 見表2。

注：與假手術組同時點比較，*P<0.05；與模型組同時點比較，#P<0.05。

2.3 各組腦組織Homer-1a mRNA比較 見表3。

注：與假手術組同時點比較，*P<0.05；與模型組同時點比較，#P<0.05。

2.4 腦組織Honer-1a mRNA表達與血清S-100β的關系 相關性分析結果顯示，在所有大鼠樣本中，腦組織中Homer-1a mRNA表達與血清S-100β水平呈負相關(r=-0.939，P<0.01)。

3 討論

腦組織具有高代謝率的特點，缺血導致缺氧可影響神經元代謝，造成嚴重神經組織損傷。近年來，越來越多的麻醉藥物被用于缺血缺氧性腦損傷的治療，發(fā)揮了良好的腦保護作用。本研究結果也進一步驗證了丙泊酚具有抗腦缺血性損傷的腦保護作用。對于麻醉藥物的抗腦缺血性神經損傷的保護作用機制，早期研究認為與其減少生理電活動從而降低代謝率有關。但近年的研究發(fā)現，與麻醉藥物阻止缺氧時鈉、鈣離子變化，抑制谷氨酸的毒性損傷能力及其抗腦缺血缺氧損傷的保護作用相關。

Homer-1a屬于短片段Homer家族蛋白。研究[10～12]發(fā)現，敲除Homer-1a基因的小鼠表現出神經精神功能異常；大鼠腦挫傷后Homer-1a蛋白表達降低，Homer-1a蛋白參與腦損傷修復過程；說明Homer-1a在缺血性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現，丙泊酚可提高缺血再灌注大鼠腦組織Homer-1a mRNA表達，說明丙泊酚的腦保護作用可能與其調節(jié)Homer-1a水平有關。

研究發(fā)現，通過與mGluR、IP3R和NMDA受體等Homer相關蛋白結合，Homer-1a參與代謝性氨基酸受體信號轉導調節(jié)以及多巴胺信號通路的調節(jié)，從而發(fā)揮其作為負向調節(jié)蛋白的作用[13～16]。但在腦保護過程中，Homer-1a的作用機制尚未完全闡明。本研究同步檢測血清S-100β水平。S-100β是公認的早期腦組織缺血缺氧性損傷的金標準[17]。結果發(fā)現模型組、丙泊酚組血清S-100β水平均較假手術組顯著升高，但丙泊酚組升高幅度不及模型組；在所有大鼠樣本中Homer-1a與S-100β呈負相關。以上結果說明Homer-1a可能通過拮抗S-100β的作用而發(fā)揮其腦保護作用。

總之，丙泊酚麻醉可通過誘導腦組織Homer-1a mRNA表達發(fā)揮對腦缺血再灌注大鼠的腦保護作用，該作用可能與其降低外周血S-100β水平有關。

[1] Wise-Faberowski L, Raizada MK, Sumners C. Oxygen and glucose deprivation-induced neuronal apoptosis is attenuated by halothane and isoflurane[J]. Anesth Analg, 2001,93(5):1281-1287.

[2] Nishizawa Y. Glutamate release and neuronal damage in ischemia[J]. Life Sci, 2001,69(4):369-381.

[3] Warner DS. Isoflurane neuroprotection: a passing fantasy, again[J]. Anesthesiology, 2000,92(5):1226-1228.

[4] 賈東林,褚曉玉,張利萍.丙泊酚對自由基引起的大鼠腦皮質線粒體損傷的保護作用[J].中國臨床藥理學與治療學,2007,12(7):763-765.

[5] Wu XJ, Zheng YJ, Cui YY, et al. Propofol attenuates oxidative stress-induced PC12 cell injury via p38 MAP kinase dependent pathway[J]. Acta Pharmacol Sin, 2007,28(8):1123-1128.

[6] Xiao B, Tu JC, Patralia RS, et al. Homer regulates the association of group 1 metabotropic glutamate receptors with multivalent complexes of homer-related, synaptic proteins[J]. Neuron, 1998,21(4):707-716.

[7] Foa L, Gasperini R. Development roles for Homer: more than just a pretty scaffold[J]. J Neurochem, 2009,108(1):1-10.

[8] Szumlinski KK, Ary AW, Lominac KD. Homers regulate drug-induced neuroplasticity: implications for addiction[J]. Biochem Pharmcol, 2008,75(1):112-133.

[9] Zea Longa E, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1):84-91.

[10] Szumlinski KK, Lominac KD, Kleschen MJ, et al. Behavioral and neurochemical phenotyping of Homer 1 mutant mice: possible relevance to schizophrenia[J]. Genes Brain Behav, 2005,4(5):273-288.

[11] Huang WD, Fei Z, Zhang X, et al. Traumatic injury induced homer-1a gene expression in cultured corticed neurons of rat[J]. Neurosci Lett, 2005,389(1):46-50.

[12] Shiraishi Y, Furuichi T. The Homer family proteins[J]. Genome Biology, 2007,8(2):206.

[13] Hu SJ, Xing JL. An experimental model for chronic compression of dorsal root ganglion produced by intervertebral foramen stenosis in the rat[J]. Pain, 1998,77(1):15-23.

[14] Lominac KD, Oleson EB, Pava M, et al. Distinct roles for different Homer 1 isoforms in behaviors and associated prefrontal cortex function[J]. J Neurosci, 2005,25(50):11586-11594.

[15] Bottai D, Guzowski JF, Schwarz MK, et al. Synaptic activity-induced conversion of intronic to exonic sequence in Homer 1 immediate early gene expression[J]. J Neurosci, 2002,22(1):167-175.

[16] Yamada H, Kuroki T, Nakahara T, et al. The dopamine D1 receptor agonist, but not the D2 receptor agonist, induces gene expression of Homer 1a in rat striatum and nucleus accumbens[J]. Brain Res, 2007,1131(1):88-96.

[17] Pankova TM, Starostina MV, Shtark MB, et al. Neuroprotective effect of ultra-low doses of antibodies against S100 protein in neuroblastoma culture during oxygen and glucose deprivation[J]. Bull Exp Biol Med, 2007,144(3):288-290.

Effect of propofol on expression of Homer-1a in cerebral ischemia reperfusion rats and the mechanism

SHENDa-chuan1,DONGBin,WENChao

(1TielingCentralHospital,Tieling112001,China)

Objective To observe the effect of propofol on the expression of Homer-1a in the brain tissues of cerebral ischemia reperfusion rats, and to explore its mechanism. Methods A total of 120 male SD rats were randomly divided into the sham operation group, model group and propofol group, 40 rats in each group. Cerebral ischemia reperfusion rat models were established in the model group and propofol group by using the suture method; sham operation group only

vascular separation processing, without line bolt insertion. Thirty min after modeling, rats in the propofol group were given propofol 10 mg/100 g by intraperitoneal injection, while rats in the sham operation and control groups were injected the same amount of normal saline. After the drug treatment for 3 h, 24 h, 72 h and 7 d, neurological function score was evaluated, Homer-1a mRNA level in the brain tissues was detected by using the real-time PCR, and S-100β in the peripheral blood was detected by enzyme linked immunosorbent assay. Results Compared with the sham operation group, the neurological function scores and S-100β levels of peripheral blood were increase at the four time points in the model and propofol groups (allP<0.05), and the model group increased more significantly (allP<0.05). Compared with the sham operation group, the level of Homer-1a mRNA decreased in the model group at the time points of 3 h and 24 h (allP<0.05). The Homer-1a mRNA level of the propofol group was higher than those in the other two groups at the four time points (allP<0.05). In all rat samples, Homer-1a mRNA expression level and S-100β level was negatively correlated (r=-0.939,P<0.01). Conclusion Propofol anesthesia has a protective effect on the brain tissues in the cerebral ischemia reperfusion rats by inducing Homer-1a mRNA expression, and this effect may be related to the decrease of S-100β level in the peripheral blood.

ischemia reperfusion injury; brain tissues; propofol; Homer-1a gene; S-100β; rats

國家自然科學基金資助項目(81371454)。

沈大川(1971-)，男，副主任醫(yī)師，研究方向小兒麻醉。E-mail: 934637173@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.004

R743.3

A

1002-266X(2015)12-0014-03

2014-11-30)