李娟，李宗恒，唐利，李燕，陳莊

(1瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000；2瀘州醫(yī)學(xué)院)

外陰鱗狀上皮增生皮損組織中K17、IFN-γ、PCNA的表達(dá)變化及意義

李娟1，李宗恒1，唐利2，李燕2，陳莊2

(1瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000；2瀘州醫(yī)學(xué)院)

目的 觀察外陰鱗狀上皮增生皮損組織中角蛋白17(K17)、干擾素γ(IFN-γ)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 外陰鱗狀上皮增生患者27例，取其皮損組織作為A組，取病灶周圍正常皮膚組織作為B組。采用免疫組化SP法檢測(cè)兩組PCNA、K17和IFN-γ的表達(dá)，并分析其相關(guān)性。結(jié)果 A組增殖指數(shù)26.24%±6.60%，B組10.47%±4.77%，P<0.01。A組K17、IFN-γ的光密度值均高于B組(P均<0.01)。B組K17與IFN-γ的表達(dá)無相關(guān)性(r=0.122，P>0.05)，A組K17與IFN-γ表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.607，P<0.01)。結(jié)論 外陰鱗狀上皮增生可能與皮損組織中PCNA、K17、IFN-γ表達(dá)增加有關(guān)。

外陰鱗狀上皮增生；角蛋白17；干擾素γ；增殖細(xì)胞核抗原；免疫組織化學(xué)

外陰鱗狀上皮增生屬于外陰白色病變的一種類型，迄今發(fā)病機(jī)制尚未闡明。研究認(rèn)為，T細(xì)胞介導(dǎo)的局部免疫失調(diào)在外陰白色病變的發(fā)病中可能發(fā)揮一定作用[1]。由Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素12(IL-12)、干擾素γ(IFN-γ)在外陰白色病變組織中表達(dá)明顯高于正常皮膚組織[2]。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ通過促進(jìn)角蛋白17(K17)表達(dá)及K17和T細(xì)胞之間形成互相促進(jìn)的環(huán)路，在銀屑病的發(fā)病、加重、慢性化及復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]；此外，在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖、分化時(shí)，都可出現(xiàn)K17的異常表達(dá)[4]。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，參與DNA的合成，是反映細(xì)胞增殖活性的常用指標(biāo)。本研究觀察外陰鱗狀上皮增生皮損組織PCNA、K17、IFN-γ的表達(dá)情況，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010年3月～2013年9月瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治外陰鱗狀上皮增生患者27例，均經(jīng)臨床及病理確診，年齡40～60歲、平均46歲，2個(gè)月內(nèi)均未接受局部皮損治療及服用皮質(zhì)類固醇激素、免疫抑制劑，分別取其外陰鱗狀上皮增生皮損組織作為A組，病灶周圍正常皮膚組織作為B組。

1.2 方法

1.2.1 病理觀察 采用HE染色。將A、B組標(biāo)本常規(guī)用4%甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟至水，常規(guī)HE染色，乙醇梯度脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察組織及細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 皮膚組織PCNA、K17、IFN-γ檢測(cè) 采用免疫組化SP法。分別將A、B組皮膚組織進(jìn)行石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，放入檸檬酸修復(fù)液內(nèi)修復(fù)，3% H2O2封閉阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS反復(fù)清洗，加入PCNA、K17、IFN-γ一抗(工作液濃度均為1∶100)，4 ℃過夜；加入二抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色。增殖指數(shù)：隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(Olympus顯微鏡，CX-31型，物鏡400倍)，計(jì)算PCNA陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)，計(jì)數(shù)3次取平均值即為增殖指數(shù)。K17、IFN-γ：采用Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，在相同的放大倍數(shù)下每個(gè)切片計(jì)數(shù)10個(gè)視野，以陽性細(xì)胞染色的光密度值(OD值)表示表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組HE染色結(jié)果 A組表皮角化過度，棘層肥厚，上皮嵴不同程度向下延伸，真皮淺層有不同程度淋巴細(xì)胞和少量漿細(xì)胞；B組無上述病理表現(xiàn)，顯示正常皮膚組織。

2.2 兩組增殖指數(shù)比較 A組增殖指數(shù)為26.24%±6.60%，B組為10.47%±4.77%，P<0.01。兩組PCNA免疫組化染色結(jié)果見插頁Ⅰ圖2。

2.3 兩組K17、IFN-γ陽性染色細(xì)胞定位及定量結(jié)果比較 A組K17、IFN-γ的OD值分別為0.198 9±0.043 9、0.212 3±0.042 7，B組分別為0.115 4±0.038 4、0.069 6±0.058 8，兩組比較P均<0.01。兩組K17、IFN-γ陽性染色細(xì)胞定位見表1，免疫組化染色結(jié)果見插頁Ⅰ圖2。

2.4 相關(guān)性分析結(jié)果 B組K17與IFN-γ無相關(guān)性(r=0.122，P>0.05)。A組K17和IFN-γ呈正相關(guān)(r=0.607，P<0.01)。

3 討論

外陰鱗狀上皮增生是以外陰鱗狀上皮細(xì)胞良性增生為主要病理改變的外陰疾病，并出現(xiàn)外陰皮膚和黏膜色素改變和變性，是常見女性外陰慢性疾病[1]。

PCNA是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，從G1后期PCNA表達(dá)就開始增加，S期持續(xù)在高水平[5,6]，其表達(dá)水平能夠較準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的生長速度，與細(xì)胞增殖狀態(tài)密切相關(guān)，是反映細(xì)胞增殖活性的常用指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，外陰鱗狀上皮增生皮損組織增殖指數(shù)明顯高于正常皮膚組織；說明外陰鱗狀上皮增生皮損組織的細(xì)胞增殖活性強(qiáng)，處于增殖狀態(tài)。

角蛋白是一種廣泛存在于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的蛋白，具有顯著多樣性[7]，具有維持細(xì)胞分化、參與細(xì)胞定位等功能[8]。角蛋白的特異性表達(dá)依賴于細(xì)胞類型、組織類型、發(fā)展階段、分化狀況及疾病的影響等[9,10]。在生理情況下，K17主要在汗腺基底細(xì)胞、外毛根鞘及皮膚基底細(xì)胞表達(dá)[11]；在病理情況下，如創(chuàng)面愈合的表皮、炎癥性皮膚病、某些皮膚腫瘤及病理性或轉(zhuǎn)化型增生組織K17常過度表達(dá)[12]。在本研究中，K17主要表達(dá)于正常皮膚組織的基底層、外陰鱗狀上皮增生皮損組織的全層，且外陰鱗狀上皮增生皮損組織中K17表達(dá)較正常皮膚組織明顯增多；說明K17異常過多表達(dá)可能是表皮增殖過度、生長速度明顯快于正常皮膚的原因之一。

研究發(fā)現(xiàn)，外陰鱗狀上皮增生皮損組織IL-12、IFN-γ的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照皮膚組織[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ主要表達(dá)于外陰鱗狀上皮增生皮損組織的全層，表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常皮膚組織；說明IFN-γ參與外陰鱗狀上皮增生的發(fā)病，其異常增多可能是表皮從正常發(fā)展為外陰鱗狀上皮增生的重要原因之一。

本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，正常皮膚組織中IFN-γ和K17無相關(guān)性，外陰鱗狀上皮增生皮損組織中IFN-γ與K17呈正相關(guān)。機(jī)制可能為，病理情況下角質(zhì)形成細(xì)胞主要對(duì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子起反應(yīng)，細(xì)胞因子IFN-γ可以激活STAT1特異的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而促進(jìn)表皮細(xì)胞K17基因表達(dá)[13]。體外研究證實(shí)，IFN-γ可以誘導(dǎo)K17表達(dá)，K17是迄今為止報(bào)道的IFN-γ能惟一誘導(dǎo)表達(dá)的一種角蛋白[14]。

綜上推測(cè)，各種內(nèi)外因素刺激外陰皮膚，使外陰真皮中的慢性炎細(xì)胞釋放以Th1型細(xì)胞為主的細(xì)胞因子，其中 IFN-γ為主的細(xì)胞因子被激活，使STAT1誘導(dǎo)K17基因大量表達(dá)，導(dǎo)致表皮組織中K17大量表達(dá)[15]，角質(zhì)形成細(xì)胞大量增生，促進(jìn)棘層肥厚、表皮增生[16]、過度角化等改變，導(dǎo)致炎因子持續(xù)存在，最終導(dǎo)致外陰鱗狀上皮增生的發(fā)生、發(fā)展。

文中針對(duì)傳統(tǒng)空時(shí)結(jié)構(gòu)對(duì)時(shí)變干擾應(yīng)對(duì)能力較差的問題，提出了空時(shí)頻抗干擾結(jié)構(gòu)，不僅能夠有效地抑制大量寬帶干擾和窄帶干擾[19-20]，同時(shí)改進(jìn)的子空間估計(jì)算法能快速的估計(jì)時(shí)變的干擾子空間以及信號(hào)子空間，估計(jì)誤差大大降低，從而提高了PASTd算法的魯棒性，對(duì)于干擾源實(shí)時(shí)變化和高動(dòng)態(tài)環(huán)境下的抗干擾技術(shù)研究，有著較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和意義。

[1] 陳陽陽.外陰白色病變的病因探討及治療進(jìn)展[D].長春：吉林大學(xué),2013:19-21.

[2] 祝青.聚焦超聲治療外陰白色病變前后細(xì)胞因子的變化[J].內(nèi)江科技,2012,17(9):60-62.

[3] 王剛,劉玉峰.治療銀屑病的一個(gè)新的藥物作用靶標(biāo)——角蛋白17[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2005,19(12):753-754.

[4] Leigh IM, Navsaria H, Purkis PE, et al. Keratins (K16 and K17) as markers of keratinocyte hyperproliferation in psoriasis in vivo and in vitro[J]. Br J Dermatol, 1995,133(4):501-511.

[5] Prelich G, Tan CK, Kosture M, et al. Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and a DNA polymyrasedaltal auxiliary protein[J]. Nature, 1987,326(6112):517-520.

[6] Lake-Bakaar G, Mazzoccoli V, Ruffini L. Digital image analysis of the distribution of proliferating cell nuclear antigen in hepatitis C virus-related chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma[J]. Dig Dis Sci, 2002,47(7):1644-1648.

[7] Chen SH, Arany I, Apisarnthanarax N, et al. Response of keratinocytes from normal and psoriatic epidermis to interferon-gamma differs in the expression of zinc-alpha (2)-glycoprotein and cathepsin[J]. FASEB J, 2000,14(3):565-571.

[8] 張學(xué)軍,劉維達(dá),何春滌.現(xiàn)代皮膚性病學(xué)基礎(chǔ)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:320-321.

[9] Cheng J, Turksen K, Yu QC, et al. Cachexia and graft-vs.-host-disease-type skin changes in keratin promoter-driven TNF alpha transgenic mice[J]. Genes Dev, 1992,6(8):1444-1456.

[10] Greenhalgh DA, Welty DJ, Player A, et al. Two oncogenes, v-fos and v-ras, cooperate to convert normal keratinocytes to squamous cell carcinoma[J]. Proc Natl Acad Sci, 1990,87(2):643-647.

[11] Wei L, Debets R, Hegmans JJ, et al. IL-1 beta and IFN-gamma induce the regenerative epidermal phenotype of psoriasis in the transwell skin organ culture system. IFN-gamma up-regulates the expression of keratin 17 and keratinocyte transglutaminase via endogenous IL-1 production[J]. J Pathol, 1999,187(3):358-364.

[12] Machesney M, Tidman N, Waseem A, et al. Activated keratinocytes in the epidermis of hypertrophic-scars[J]. Am J Pathol, 1998,152(5):1133-1141.

[13] Jiang CK, Flanagan S, Ohtsuki M, et al. Disease-activated transcription factor: allergic reactions in human skin cause nuclear translocation of STAT-91 and induce synthesis of keratin K17[J]. Mol Cell Biol, 1994,14(7):4759-4769.

[14] Flohr T, Buwitt U, Bonnekoh B, et al. Interferon-gamma regulates expression of a novel keratin class I gene[J]. Eur J Immunol, 1992,22(4):975-979.

[15] Wilson CL, Dean D, Lane EB, et al. Keratinocyte differentiation in psoriatic scalp: morphology and expression of epithelial keratins[J]. Br J Dermatol, 1994,131(2):191-200.

[16] 趙辨.中國臨床皮膚病學(xué)[M].南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2010:44-45.

Expression and significance of K17, IFN-γ and PCNA in skin lesions of patients with squamous hyperplasia of vulva

LIJuan1,LIZong-heng,TANGLi,LIYan,CHENZhuang

( 1TheAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China)

Objective To observe the expression levels of the keratin 17 (K17), interferon-γ (IFN-γ) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in skin lesions of patients with squamous hyperplasia of vulva, and to explore their significance. Methods Twenty-seven patients with squamous hyperplasia of vulva, the lesions were taken as group A and the normal epidermis surrounding the lesions as the group B. The expression levels of PCNA, K17 and IFN- γ were detected by the immunohistochemical SP method, and the correlations with the squamous hyperplasia of vulva were analyzed. Results The proliferation indexes of group A and group B were 26.24%±6.60% and 10.47%±4.77%, respectively (P<0.01). The average optical density of K17 and IFN- γ in the group A was significantly higher than that in the group B (allP<0.01). In the group B, the expression of K17 was not related with the IFN-γ expression (r=0.122，P>0.05). In the group A, the expression of K17 was positively correlated with the IFN-γ expression (r=0.607，P<0.01). Conclusion The increased expression levels of K17, IFN-γ and PNCA in the skin lesions of patients with squamous hyperplasia of vulva has significantly relevance to its pathogenesis.

squamous hyperplasia of vulva; keratin 17; interferon-γ; proliferating cell nuclear antigen; immunohistochemistry

瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院研究項(xiàng)目(09053)。

李娟(1984-)，女，碩士研究生，主要從事皮膚免疫病理學(xué)及小兒疾病研究。E-mail: lijuanyoyo@foxmail.com

陳莊(1954-)，男，博士，研究員，主要從事免疫病理學(xué)研究。E-mail: 917744799@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.007

R751；R36

A

1002-266X(2015)12-0024-03

2014-05-16)