張彬，湛梅圣，趙玉璽，王萬(wàn)垠，楊建強(qiáng)，沈建強(qiáng)，劉運(yùn)華，唐金兵，李彥國(guó)，吳璇

(棗陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，湖北棗陽(yáng)441200)

BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物的制作及其在兔尺骨骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用

張彬，湛梅圣，趙玉璽，王萬(wàn)垠，楊建強(qiáng)，沈建強(qiáng)，劉運(yùn)華，唐金兵，李彥國(guó)，吳璇

(棗陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，湖北棗陽(yáng)441200)

目的 制作兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)-骨形態(tài)蛋白2(BMP2)-煅燒牛骨復(fù)合物，并觀察其在兔尺骨骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用。方法 將兔BMSCs分離、培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)后，接種于BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物，掃描電鏡下觀察復(fù)合情況。將54只新西蘭大白兔隨機(jī)分為觀察組、對(duì)照組、空白組各18只，于無(wú)菌條件下造成右側(cè)尺骨中段10 mm長(zhǎng)缺損。觀察組植入BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物，對(duì)照組植入BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物，空白組不植入任何材料，術(shù)后均不做任何內(nèi)外固定。各組術(shù)后4、8、12周每組隨機(jī)處死6只，分別行骨缺損處的放射學(xué)和組織學(xué)檢查。結(jié)果 成骨誘導(dǎo)后的BMSCs均勻分布在煅燒骨表面及孔洞內(nèi)，與煅燒骨表面貼附緊密，細(xì)胞呈圓形，表面光滑，胞體較大，直徑15 μm。隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，觀察組和對(duì)照組Lane-Sandhu放射學(xué)評(píng)分、組織學(xué)評(píng)分均逐漸升高，P均<0.05；空白組無(wú)變化，P均>0.05。術(shù)后4、8、12周，觀察組和對(duì)照組Lane-Sandhu放射學(xué)評(píng)分、組織學(xué)評(píng)分均高于空白組，觀察組升高更明顯，P均<0.05。結(jié)論 BMSCs能夠較好地與BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物植入有助于兔尺骨骨缺損的修復(fù)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；骨形態(tài)蛋白2；煅燒牛骨；骨缺損；兔

治療骨缺損最理想的材料是自體骨，但自體骨來(lái)源有限，取骨增加患者痛苦。骨組織工程學(xué)的提出為這一難題的解決提出了新思路，體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在特定的誘導(dǎo)條件下可定向分化為具有典型表型特征的成骨細(xì)胞[1]。誘導(dǎo)后的BMSCs可與合適的載體復(fù)合[2]，而煅燒牛松質(zhì)骨具有良好的組織相容性和可靠的生物安全性，孔隙率高有利于成骨細(xì)胞的長(zhǎng)大和分化，是一種理想的生物支架材料[3]。骨形態(tài)蛋白2(BMP2)能夠極好地模擬天然骨基質(zhì)促發(fā)及指導(dǎo)礦化功能，在局部形成偏酸環(huán)境，促進(jìn)局部鈣磷沉積、成核和生物自組裝礦化[4,5]。2013年1月～2014年7月，我們制作了BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物，并用于修復(fù)兔尺骨骨缺損，取得了較好效果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 4月齡新西蘭大白兔64只(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心),雌雄不限,體質(zhì)量2.0～2.5 kg。DulbeccoMEM(DMEM)培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)，Percoll細(xì)胞分離液(美國(guó)Amshan-Pharmacia公司)，胎牛血清(FBS,美國(guó)Gibco公司)，四甲基噻唑藍(lán)(MTT,美國(guó)Gibco公司)，麥胚凝集素(Sigma公司)。BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨疾病研究所)，SW-CJ-LF凈化工作臺(tái)(蘇州安泰公司)，細(xì)胞培養(yǎng)板(德國(guó)葛萊娜第一生化股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔BMSCs的分離、培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo) 取新西蘭大白兔10只，采用全骨髓法離心分離兔股骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞。以3×106/mL接種至100 mL培養(yǎng)瓶，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度孵育箱內(nèi)孵育。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，0.25%胰蛋白酶進(jìn)行1∶4消化傳代，接種密度為2×105/mL,繼續(xù)用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10×103mol/L的β-甘油磷酸鈉、50 mg/L的L-抗壞血酸、1×10-8mol/L的地塞米松)培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)3周后行改良鈣鈷法堿性磷酸酶(ALP)染色和鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色，評(píng)估成骨誘導(dǎo)效果。ALP染色：取第3代細(xì)胞爬片,采用改良鈣鈷法ALP染色,甲基綠復(fù)染。鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色：取第3代細(xì)胞爬片,形成鈣化結(jié)節(jié)后取出,95%乙醇固定后,0.1%茜素紅-Tris-HCl漂染30 min。將已形成鈣化結(jié)節(jié)的細(xì)胞爬片,加入100 mg/L四環(huán)素,培養(yǎng)30 min后,更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)30 min，PBS液漂洗2次，95%乙醇固定，在反射熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物的制作 ddH2O沖洗BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物,自然干燥后環(huán)氧乙烷滅菌，置于6孔培養(yǎng)板中。加入DMEM培養(yǎng)液浸泡過(guò)夜,吸出DMEM培養(yǎng)液備用。取成骨誘導(dǎo)3周后兔BMSCs,經(jīng)消化、離心、重懸后，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度為1×105/mL,直接接種到備用的BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物上,置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h。將復(fù)合物翻面再次接種細(xì)胞,每次接種盡量使細(xì)胞充分滲進(jìn)BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物中，光鏡下觀察復(fù)合情況。

1.2.3 BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物的應(yīng)用

1.2.3.1 造模與分組處理 將54只新西蘭大白兔隨機(jī)分為觀察組、對(duì)照組、空白組各18只，參照鄭啟新、段智霞等[3,5]的方法，于無(wú)菌條件下造成右側(cè)尺骨中段10 mm長(zhǎng)缺損。造模完成后，觀察組立即植入BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物，對(duì)照組植入BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物，空白組不植入任何材料，術(shù)后均不做任何內(nèi)外固定。

1.2.3.2 骨缺損修復(fù)情況觀察 各組術(shù)后4、8、12周隨機(jī)處死6只新西蘭兔，分別進(jìn)行放射學(xué)和組織學(xué)檢查。放射學(xué)檢查：對(duì)兔骨缺損修復(fù)肢行X線攝片，觀察其骨缺損修復(fù)情況，并進(jìn)行Lane-Sandhu放射學(xué)評(píng)分。組織學(xué)檢查：放射學(xué)檢查完成后，在麻醉狀態(tài)下處死動(dòng)物，立即以尺骨骨缺損部位為中心取約3 cm不含軟組織的完整尺骨，4%甲醛固定24 h，依次進(jìn)行脫鈣、脫水、石蠟包埋切片及HE染色處理，光鏡下觀察，并進(jìn)行Lane-Sandhu組織學(xué)評(píng)分。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物的制作效果

2.1.1 細(xì)胞成骨能力 光鏡下ALP染色的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)大量黑色或褐色顆粒沉淀(見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖1A),鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色顯示較多深紅色鈣化結(jié)節(jié)(見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖1B)；反射熒光顯微鏡下四環(huán)素?zé)晒馊旧?見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié)呈強(qiáng)烈的金黃色熒光改變(見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖1C) 。

2.1.2 細(xì)胞復(fù)合情況 成骨誘導(dǎo)后的BMSCs均勻分布在煅燒骨表面及孔洞內(nèi),與煅燒骨表面貼附緊密,細(xì)胞呈圓形,表面光滑,胞體較大,直徑15 μm。

2.2 BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物修復(fù)骨缺損效果

2.2.1 放射學(xué)檢查結(jié)果 觀察組術(shù)后4周，骨缺損處有新生骨，缺損界面模糊縮小，可見(jiàn)均勻的骨痂影，出現(xiàn)不規(guī)則密度降低區(qū)；術(shù)后8周，缺損區(qū)界線模糊，有較多密度增高的骨痂陰影，與骨斷端融合界限不清，移植骨部分吸收，與骨缺損區(qū)連接模糊明顯縮小；術(shù)后12周，新骨充滿整個(gè)缺損區(qū)，高密度的阻射影均勻一致，骨斷端與缺損區(qū)融合，髓腔再通，已接近正常骨組織。對(duì)照組術(shù)后4周，骨缺損處有少量骨癡形成，骨界線模糊，相對(duì)變化不明顯；術(shù)后8周，缺損處有所縮小，與4周時(shí)比較，變化不明顯；術(shù)后12周，缺損處有大量新骨形成，缺損處明顯填充，但未完全愈合。空白組術(shù)后4、8、12周均無(wú)明顯變化，骨缺損區(qū)仍然存在。各組術(shù)后4、8、12周Lane-Sandhu放射學(xué)評(píng)分比較，見(jiàn)表1。

注：與空白組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05；與同組術(shù)后4周比較，△P<0.05；與同組術(shù)后8周比較，○P<0.05。

2.2.2 組織學(xué)檢查結(jié)果 觀察組術(shù)后4周，移植復(fù)合物內(nèi)開(kāi)始有新生微血管生成，內(nèi)部孔隙可見(jiàn)類基質(zhì)沉積,含胞質(zhì)豐富的成骨細(xì)胞；術(shù)后8周，可見(jiàn)骨小梁增粗、變大,新生成骨細(xì)胞增生活躍,編織骨基本改建為板層骨,可見(jiàn)哈弗管結(jié)構(gòu)；術(shù)后12周，移植區(qū)域出現(xiàn)大量成熟骨結(jié)構(gòu),骨皮質(zhì)連續(xù),缺損區(qū)域骨結(jié)構(gòu)與正常骨結(jié)構(gòu)大致相同, 破骨細(xì)胞增生活躍，髓腔通暢。對(duì)照組術(shù)后4周，可見(jiàn)骨小梁不整齊伴骨基質(zhì)生成,其邊緣的成骨細(xì)胞多呈單層增生；術(shù)后8周，可見(jiàn)大量的骨小梁排列不規(guī)則,少量板層骨形成,成骨細(xì)胞增生活躍,類骨組織轉(zhuǎn)為編織骨；術(shù)后12周，可見(jiàn)大量條索狀板層骨形成伴編織骨,骨細(xì)胞排列整齊,骨小梁較前期粗大?？瞻捉M術(shù)后4周，可見(jiàn)活躍的成纖維細(xì)胞,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)伴結(jié)締組織增生,散在的骨小梁生成；術(shù)后8周，可見(jiàn)明顯的炎性反應(yīng),骨小梁生成較前成熟,其周圍大量活躍的成纖維細(xì)胞；術(shù)后12周，可見(jiàn)纖維結(jié)締組織充填缺損區(qū),沒(méi)有成骨表現(xiàn)。各組術(shù)后4、8、12周Lane-Sandhu組織學(xué)評(píng)分比較，見(jiàn)表2。

注：與空白組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05；與同組術(shù)后4周比較，△P<0.05；與同組術(shù)后8周比較，○P<0.05。

3 討論

目前的研究認(rèn)為,骨缺損修復(fù)的基本條件主要包括適宜的種子細(xì)胞、支架材料及可用的細(xì)胞因子[6]。適宜的種子細(xì)胞是人工植骨材料進(jìn)行修復(fù)的基礎(chǔ)， BMSCs作為骨組織工程中首選的種子細(xì)胞,具有取材方便、增殖能力和成骨能力強(qiáng)、免疫原性弱等優(yōu)點(diǎn)[7]。BMSCs在體外、體內(nèi)均有向多種間質(zhì)細(xì)胞譜系分化的能力，因此在目前骨組織工程中應(yīng)用非常普遍[8]。BMSCs在成人骨髓中占有核細(xì)胞的0.000 1%～0.01%，所以需要經(jīng)體外培養(yǎng)分離擴(kuò)增，才能滿足需要[9，10]。本研究從兔股骨中分離出BMSCs,經(jīng)過(guò)分離、培養(yǎng)、純化及體外誘導(dǎo)，對(duì)誘導(dǎo)分化后的成骨細(xì)胞進(jìn)行改良鈣鈷法ALP染色和鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色鑒定成骨的性能,初步建立了體外大量獲取成骨能力肯定的骨組織工程種子細(xì)胞的一種有效方法,為后期骨缺損的再生性修復(fù)提供前期研究基礎(chǔ)。

BMPs廣泛存在于動(dòng)物骨豁、牙齒中，是一類能夠提供間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的始發(fā)信號(hào)的低分子糖蛋白,主要是誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞發(fā)展[11，12],其中BMP2的誘導(dǎo)成骨作用是BMPs家族中最強(qiáng)的[13，14]。煅燒骨是一種以羥基磷灰石為主要成分的生物材料，通過(guò)煅燒可將骨中的全部有機(jī)物氧化清除，徹底消除異種抗原，同時(shí)還能保留動(dòng)物骨原有的無(wú)機(jī)鹽骨架并形成高度多孔結(jié)構(gòu)，以適合成骨細(xì)胞移行并快速修復(fù)骨缺損。鄭啟新等[3]研究表明, 煅燒牛松質(zhì)骨具有一定的強(qiáng)度,孔徑合適, 微孔互相連通, 有可靠的生物安全性, 可作為植骨材料。臨床研究表明，煅燒骨作為支架材料復(fù)合鋅離子在動(dòng)物骨缺損修復(fù)中取得了滿意療效[15]。

本研究將BMSCs和BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，能夠更好地彌補(bǔ)單一元素應(yīng)用受到的限制，發(fā)揮種子細(xì)胞、細(xì)胞因子、支架材料的協(xié)同作用，更好地適合微血管、肉芽纖維組織的長(zhǎng)入，以及骨與軟骨組織的分化形成，并可促進(jìn)支架材料的吸收降解。本研究結(jié)果表明，隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，觀察組和對(duì)照組Lane-Sandhu放射學(xué)評(píng)分、組織學(xué)評(píng)分均逐漸升高(P均<0.05)；術(shù)后4、8、12周，觀察組和對(duì)照組Lane-Sandhu放射學(xué)評(píng)分、組織學(xué)評(píng)分均高于空白組，觀察組升高更明顯(P均<0.05)。放射學(xué)和組織學(xué)檢查表明，術(shù)后12周，觀察組骨斷端與缺損區(qū)融合，髓腔再通，已接近正常骨組織；而對(duì)照組未完全愈合，空白組沒(méi)有成骨表現(xiàn)，骨缺損區(qū)仍然存在。本研究初步證實(shí)了BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復(fù)合物具有良好的骨缺損修復(fù)效果，為臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為骨修復(fù)材料的研制提供了新的思路。

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Fabrication of BMSCs/BMP-2/calcined bone complex and its application in the repair of bone defect of rabbit ulna

ZHANGBin,ZHANMei-sheng,ZHAOYu-xi,WANGWan-yin,YANGJian-qiang,SHENJian-qiang,LIUYun-hua,TANGJin-bing,LIYan-guo,WUXuan

(TheFirstPeople'sHospitalofZaoyang,Zaoyang441200,China)

Objective To make the rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)/bone morphogenetic protein 2 (BMP2)/calcined bone complex, and to observe its application in the repair of bone defect of rabbit ulna. Methods After the isolation, culture and osteogenic induction of rabbit BMSCs, we inoculated on BMP2/calcined bone complex, and observed the compound situation under scanning electron microscope. Fifty-four New Zealand white rabbits were randomly divided into the experimental group, control group, and blank group with 18 rats in each group. Under the sterile conditions, 10 mm defect of the right middle ulna was made. The experimental group was implanted BMSCs/BMP2/calcined bone complexes, while the control group was implanted BMP2/calcined bone complexes, and the blank group without any implantation. After the operation, we did not make any internal and external fixation. After operation 4, 8, and 12 weeks, 6 rabbits in each group were randomly sacrificed, and the radiological and histological examinations of the bone defects were conducted. Results The BMSCs cells after the osteogenic induction uniformly distributed in the bone surface and hole, and calcined bone surface attached closely, cells were round with smooth surface, large cell body and the diameter of 15 μm. With the extension of time, the Lane-Sandhu radiological score and histological score of the experimental group and the control group were increased gradually (allP<0.05); the blank group had no change (P>0.05). Four, eight and twelve weeks after implantation, the Lane-Sandhu radiological score and histological score of the experimental group and the control group were higher than those of the control group, and the experimental group increased more significantly (allP<0.05). Conclusion BMSCs can co-culture with BMP2/calcined bone complexes better in vitro, and the implantation of BMSCs/BMP2/calcined bone complexes help the repair of rabbit ulna bone defect.

bone marrow mesenchymal stem cells; bone morphogenetic protein 2; calcined bone; bone defect; rabbits

湖北省衛(wèi)生廳科研指導(dǎo)性項(xiàng)目 (JX6C-44)。

張彬(1970-)，男，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)楣强苹A(chǔ)與臨床。E-mail: 13972058889@139.com

趙玉璽(1984-)，男，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)楣桥c關(guān)節(jié)損傷。E-mail: zyx8023wx@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.005

R318.08

A

1002-266X(2015)12-0017-04

2014-08-03)