白麗春，覃遠漢，黃韋芳，周志強，雷鳳英，陳秀萍

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

LMX1B基因突變檢測對激素耐藥型腎病綜合征患兒的早期診斷價值

白麗春，覃遠漢，黃韋芳，周志強，雷鳳英，陳秀萍

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

目的 分析LMX1B基因突變檢測對激素耐藥型腎病綜合征(SRNS)患兒的早期診斷價值。方法 正常兒童(對照組)、激素敏感型腎病綜合征患兒(SSNS組)、SRNS患兒(SRNS組)各100例，采用PCR法擴增LMX1B基因第4、5、6外顯子，以瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物后，進行單鏈構象多態(tài)性分析，對遷移率或條帶異常者進行 DNA 測序，比較3組LMX1B基因突變情況。結果 第4、5、6外顯子擴增產(chǎn)物符合LMX1B基因外顯子片段進行純化和測序標準。突變均位于第4外顯子，第5、6外顯子未發(fā)現(xiàn)明顯突變。純合錯義突變c.745G>A(R246K)SRNS組5例，SSNS、對照組均0例，SRNS組與其他兩組比較，P均<0.05；純合錯義突變c.731-733T>C、C>G、G>A(S242R)SRNS組23例、SSNS組9例、對照組2例，SRNS組與對照組比較，P<0.05；無義突變c.733-734insT(K243*)SRNS組9例、SSNS組17例、對照組0例，SRNS、SSNS組與對照組比較，P均<0.05；同義突變c.733G>C(S242S)SRNS組2例、SSNS組11例、對照組3例，P均>0.05。結論 LMX1B基因純合錯義突變c.745G>A可能是原發(fā)性腎病綜合征患兒產(chǎn)生激素耐藥的原因，檢測該指標對SRNS患兒早期診斷具有一定價值。

腎病綜合征；激素耐藥；基因突變；LMX1B基因；兒童

原發(fā)性腎病綜合征(PNS)是兒童時期常見的腎小球疾病，目前治療上首選糖皮質激素。80%～90%的PNS患兒對激素敏感，稱為激素敏感型腎病綜合征(SSNS)；但仍有10%～20%的患兒對激素耐藥，稱為激素耐藥型腎病綜合征(SRNS)，超半數(shù)的SRNS患兒在10 a內進展為終末期腎病[1～3]。SRNS患兒治療期間不僅激素使用劑量大、治療時間長，而且易出現(xiàn)嚴重代謝紊亂，增加感染機會，增加治療經(jīng)濟負擔。研究發(fā)現(xiàn)，LMX1B基因突變可在甲髕綜合征、SRNS和Alport綜合征等疾病中出現(xiàn)并導致腎臟損害[4]。另有研究認為，LMX1B可調控NPHS2基因表達，引起nephrin缺失，間接導致腎病發(fā)生[5]。本研究通過檢測SRNS患兒LMX1B基因突變情況，初步探討LMX1B基因突變檢測對SRNS患兒的早期診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010年1月～2013年2月廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院收治SRNS患兒100例(SRNS組)，男81例、女19例，年齡1～13歲；SSNS患兒100例(SSNS組)，男78例、女22例，年齡8個月～14歲；體檢健康且實驗室檢查正常者100例(對照組)，男50例、女50例，年齡2～14歲，均無腎病病史和腎病家族史。PNS、SRNS、SSNS診斷標準參照文獻[6]。

1.2 方法

1.2.1 LMX1B基因外顯子片段設計及檢測 采用PCR方法。抽取研究對象外周靜脈血2 mL，EDTAK2抗凝，3%明膠沉淀白細胞，用DNA分離試劑盒抽提基因組DNA。PCR體外擴增LMX1B基因第4、5、6外顯子片段。設計LMX1B基因片段引物序列(見表1)，PCR擴增基因3個外顯子及其周圍部分內含子。PCR反應體系(50 μL)：基因組DNA 100 ng，5 pmol/L正、反向引物各1 μL，dNTPs 200 μmol/L，MgCl2115～315 mmol/L，Taq DNA聚合酶115 U。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s、53～58 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min(循環(huán)35次)，72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物加入2%瓊脂糖凝膠電泳槽，100 V電泳30 min，紫外燈下觀察結果。

1.2.2 LMX1B基因突變單鏈構象多態(tài)性(SSCP)檢測 取6.0 μL PCR產(chǎn)物加入9 μL上樣緩沖液(含97%甲酰胺、20 mmol/L MEDTA、0.05%溴酚藍、0.05%二甲苯青FF)混勻，98 ℃變性10 min，迅速置冰上3 min。取6.5 μL上述混合液上樣于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠，以1×TBE作為電泳緩沖液，220 V預電泳30 min，80 V電泳8～10 h。銀染色后觀察結果并攝影。SSCP分析出現(xiàn)單鏈DNA條帶異常者，即與正常DNA的SSCP條帶比較，樣本DNA出現(xiàn)條帶增多、減少或位置改變均視為有突變存在；PCR產(chǎn)物以正、反向引物為測序引物，應用ABI377測序儀進行DNA檢測，采用NCBI Blast在線軟件進行序列比對，當結果顯示存在基因變異時，加測互補鏈以明確變異存在。從美國國立生物技術信息中心Nucleotide數(shù)據(jù)庫資料中獲取LMX1B基因序列(GeneBank: ID 4010，OMIM:602575)、mRNA 序列(NM_002316.3)和蛋白質序列(NP_002307.2)，根據(jù)人類DNA 序列變異命名建議命名突變基因。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LMX1B基因外顯子片段擴增及檢測結果 所設計的3對引物均有特異的擴增產(chǎn)物，與所設計擴增片段大小一致(164～252 bp)；擴增條帶單一，符合LMX1B基因外顯子片段純化和測序標準。突變均位于第4外顯子上，第5、6外顯子未發(fā)現(xiàn)明顯突變存在。

2.2 各組LMX1B基因第4外顯子基因突變及多態(tài)性比較 見表1。

注：R246K為c.745G>A；S242R為c.731-738T>C、C>G；K243*為c.733-734；S242S為c.733G>C；與對照組比較，*P<0.05；與SSNS組比較，△P<0.05。

3 討論

LMX1B基因位于常染色體9q34.1，由含有8個外顯子約82 kb的DNA編碼372個氨基酸的目標蛋白生成[7]，是一個具有LIM-同源區(qū)的轉錄因子，屬于轉錄因子家族，富含半胱氨酸和鋅結合區(qū)域，這一區(qū)域有助于該蛋白與其他轉錄因子相互作用[8]。LIM-A和LIM-B主要參與蛋白和蛋白的結合，而同源區(qū)域主要調節(jié)DNA的結合[9]。LMX1B轉錄因子同源區(qū)(第4～6外顯子)在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[7]，目前，認為該區(qū)域突變與腎臟疾病關系密切[10]。

本研究中5例SRNS患兒發(fā)現(xiàn)單雜合突變R246K，突變均位于LMX1B基因第4外顯子，轉錄因子LIM-A、LIM-B區(qū)第246位(同源區(qū)223位)精氨酸變?yōu)橘嚢彼?，堿基位于c.745位點，G→A、AGA→AAA、精氨酸→賴氨酸。該突變未在SSNS組和對照組發(fā)現(xiàn)。近期研究發(fā)現(xiàn)，LMX1B基因同源區(qū)域與腎臟正常功能的維持關系密切，其最多見的突變位點為R198X、R200Q、R208X、A213P、R223X[7]，本研究結果與文獻報道相似。Rohr等[4]研究發(fā)現(xiàn)，LMX1B基因敲除小鼠腎小球足細胞生成減少，Podocin和LMX1B共表達于足細胞；當LMX1B基因失活時，Podocin消失。Miner等[11]研究發(fā)現(xiàn)，LMX1B基因敲除小鼠其腎臟足細胞分化出現(xiàn)嚴重障礙，Podocin和CD2AP表達明顯下調。LMX1B基因調節(jié)Col-Ⅳ和Podocin的合成，與甲髕綜合征腎臟損害、Alport綜合征和SRNS發(fā)病關系密切[4]。本研究結果也提示，LMX1B基因R246K突變的PNS患兒可能更容易產(chǎn)生激素耐藥。

本研究發(fā)現(xiàn)，LMX1B基因純合錯義突變S242R，TCG→CGA、絲氨酸→精氨酸SRNS 組23例、SSNS組 9例、對照組2例，SRNS組與對照組間差異有統(tǒng)計學意義，但其余組間比較差異均無統(tǒng)計學意義；提示正常兒童如存在此突變，PNS發(fā)病率可能較一般兒童高，且更易對激素耐藥，具體機制有待進一步研究。該結果目前尚未見相關文獻報道。Dunston等[8]報道，LMX1B基因同源區(qū)位點c.725C>A、P.S242X可在甲髕綜合征中出現(xiàn)，但具體機制等未進一步闡述。本研究中K243*，密碼子由AAG轉變?yōu)門AA，導致編碼蛋白提前終止，為無義突變；其中SRNS組9例、SSNS組17例、對照組0例，SRNS、SSNS組與對照組比較P均<0.05。由此推測，該無義突變可能是引起PNS的原因之一，但該無義突變與激素敏感或耐藥無明顯相關性。該突變目前尚未見相關文獻報道，引起PNS的機制有待進一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)，S242S密碼子由 TCG轉變?yōu)門CC，均編碼絲氨酸，為同義突變；其中SSNS組11例、SRNS組2例、正常組3例，3組比較P均>0.05。該結果提示，同義突變編碼的氨基酸相同，可能是基因多態(tài)性的一種表現(xiàn)。有學者認為基因多態(tài)性即使不引起氨基酸序列的改變，也可能通過該基因轉錄產(chǎn)物mRNA結構的變化或通過轉錄過程跳躍后引起基因失活，從而導致表型變化[12]。

綜上所述，LMX1B基因純合錯義突變R246K(c.745G>A)可能是PNS患兒產(chǎn)生激素耐藥的原因，檢測該突變對SRNS早期診斷具有一定價值。

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Diagnostic value of LMX1B gene mutation detection in early diagnosis of children with steroid-resistant nephrotic syndrome

BAILi-chun,QINYuan-han,HUANGWei-fang,ZHOUZhi-qiang,LEIFeng-ying,CHENXiu-ping

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To discuss the diagnostic value of LMX1B gene mutation detection in the early diagnosis of children with steroid-resistant nephrotic syndrome (SRNS). Methods Normal children (control group), steroid sensitive nephrotic syndrome (SSNS) patients (SSNS group) and SRNS patients (SRNS group) were selected, every group contained 100 cases. We used the method of PCR-SSCP for the amplification of LMX1B gene in 4, 5, 6 exons. After using agarose gel electrophoresis to identify the products, single strand conformation polymorphism (SSCP) was used to analyze the PCR products. DNA sequencing was performed on the abnormal mobility or strips, and the mutation of LMX1B gene was compared between the 3 groups. Results The amplification products of exons 4, 5 and 6 complied with the purified and sequenced standards of LMX1B gene exon fragments. Mutations were located in the fourth exon, and no obvious mutations were found in the exons 5 and 6. Homozygous missense mutation c.745G>A (R246K), SRNS group had five cases, SSNS group and control group had zero case; LMX1B gene homozygous missense mutation c.745G>A in the three groups had statistical significance (allP<0.05); homozygous missense mutation c.731-733T>C, C>G, G>A, S242R, SRNS group had 23 cases, SSNS group had 9 cases, and the control group had 2 cases, significant difference was found between the SRNS group and the control group (allP<0.05); nonsense mutation c.733-734insT (K243*), the SRNS group had 9 cases, SSNS group had 17 cases, and none of the control group (allP<0.05); synonymous mutation c.733G>C (S242S), the SRNS group had 2 cases, the SSNS group had 11 cases, and the control group had 3 cases (allP>0.05). Conclusion LMX1B gene homozygous missense mutation c.745G>A may be the reason of the primary nephrotic syndrome in children with steroid-resistant, and it has some value in the early diagnosis of SRNS.

nephrotic syndrome; steroid-resistant; gene mutation; LMX1B gene; child

廣西科學研究與技術開發(fā)計劃課題項目(桂科攻1140003A-6)。

白麗春(1983-)，女，碩士研究生，主要研究方向為腎臟疾病。E-mail: bailichun0507@126.com

覃遠漢(1964-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導師，主要研究方向為腎臟疾病。E-mail: qinyuanhan603@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.006

R725.7

A

1002-266X(2015)12-0021-03

2014-11-03)