劉鴻，高元智，田菁菁，王學(xué)良，白劍(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng)00;遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院;沈陽(yáng)04醫(yī)院)

?；撬釋?duì)小鼠肝纖維化的抑制作用

劉鴻1，高元智2，田菁菁3，王學(xué)良1，白劍1
(1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng)110032;2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院;3沈陽(yáng)204醫(yī)院)

摘要:目的觀察四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化小鼠?；撬崽幚砬昂蟾螕p傷、纖維化、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)指標(biāo)的變化，探討?；撬釋?duì)小鼠肝纖維化的抑制作用。方法將30只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(腹腔注射橄欖油)、模型組和?；撬崽幚斫M各10只，后兩組腹腔注射四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，牛磺酸處理組造模的同時(shí)在飲水中添加?；撬?。第10周注射結(jié)束后，檢測(cè)各組小鼠血清透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、ALT、AST、IL-2、IL-6及肝臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA) ;計(jì)算肝臟指數(shù); HE和Masson染色法觀察肝臟組織病理學(xué)變化。結(jié)果與模型組比較，?；撬崽幚斫M小鼠血清中HA、LN、ALT、AST、IL-2及IL-6水平降低(P均＜0.05)，肝臟組織中SOD水平升高、MDA水平降低，肝臟指數(shù)降低(P均＜0.05)。病理檢查結(jié)果顯示，牛磺酸處理組肝臟組織中的炎性浸潤(rùn)和脂肪空泡顯著減少，無(wú)纖維組織沉積。結(jié)論?；撬釋?duì)小鼠肝纖維化具有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞:肝纖維化，小鼠;?；撬?透明質(zhì)酸;層黏連蛋白;超氧化物歧化酶;丙二醛;白細(xì)胞介素2;白細(xì)胞介素6

肝纖維化是肝細(xì)胞受到損傷或發(fā)生壞死后的常見(jiàn)反應(yīng)，其主要的病理變化是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增多，降解相對(duì)不足，ECM在肝內(nèi)過(guò)多沉積［1］。?；撬崾侨祟?lèi)和大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)的一種條件性必需氨基酸，對(duì)機(jī)體具有生理、營(yíng)養(yǎng)和藥理作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)乙酰氨基酚制備的大鼠肝損傷模型經(jīng)?；撬崽幚砗螅渭?xì)胞內(nèi)酶釋放減少，肝細(xì)胞凋亡和壞死減輕，肝臟損傷得到明顯改善［3］。2014年9～12月，本研究就?；撬釋?duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的抑制作用進(jìn)行了觀察。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物純系、雄性SPF級(jí)C57 BL/6小鼠30只，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物制品有限公司，體質(zhì)量(20 ±2) g。

1.2主要試劑?；撬?純度≥99% )購(gòu)自北京嘉康源化工有限公司;四氯化碳(分析純)購(gòu)自沈陽(yáng)寶泰克有限公司;橄欖油購(gòu)自Sigma公司; ELISA法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司; ALT和AST賴(lài)氏法測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所; Masson三色染色試劑盒購(gòu)于邁新試劑公司;維生素購(gòu)自沈陽(yáng)禾豐生物技術(shù)有限公司。

1.3分組及動(dòng)物模型制備小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由采食飲水(水中添加維生素)。1周后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為空白對(duì)照組(10只)、模型組(10只)和?；撬崽幚斫M(10只)。空白對(duì)照組按0.3 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射橄欖油;模型組和牛磺酸處理組按0.3 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射40% (體積比)四氯化碳橄欖油溶液制備肝纖維化模型，首次注射劑量0.5 mL/100g。在造模的同時(shí)，空白對(duì)照組和模型組飲用純凈水，?；撬崽幚斫M在純凈水中添加牛磺酸，濃度為2%，即2 g牛磺酸溶于100 mL水中。三組均每周注射2次，共注射10周，每周稱(chēng)取體質(zhì)量1次。

1.4觀察指標(biāo)及方法10周后處死小鼠，摘眼球取血，制備血清，檢測(cè)血清中透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白細(xì)胞介素(IL) -2和IL-6。摘取肝臟稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量)。部分肝臟儲(chǔ)存在－80℃冰箱中，用以檢測(cè)肝臟組織中的超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA) ;部分肝臟組織用10%甲醛溶液固定，采用HE和Masson染色，觀察肝臟組織病理學(xué)變化。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用珋x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三組血清HA、LN、ALT及AST水平比較三組血清HA、LN、ALT及AST水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.05)。模型組血清HA、LN、ALT及AST水平高于空白對(duì)照組(P均＜0.05)，?；撬崽幚斫MHA、LN、ALT及AST水平低于模型組(P均＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1　三組血清HA、LN、ALT及AST水平比較(±s)

注:與模型組比較，*P＜0.05;與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05。

組別　n　HA(μg/L)　LN(μg/L)　ALT(U/L)　AST(U/L)空白對(duì)照組　10　584.24±16.79　41.30±1.24　34.61±1.41　79.75±3.41模型組　10　785.43±22.22#　101.89±1.94#　371.82±6.94#　398.47±2.86#?；撬崽幚斫M　10　613.86±20.83*　67.89±1.57*　41.80±1.85*　84.58±2.86*

2.2三組肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化物及血清炎癥因子水平比較三組肝組織SOD、MDA及血清IL-2、IL-6水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05) ;與模型組比較牛磺酸處理組、SOD水平升高，MDA、IL-2、IL-6水平降低(P均＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2三組肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化物及炎癥因子水平比較(±s)

注:與模型組比較，*P＜0.05;與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05。

組別　n　SOD (U/mg)　MDA (nmol/mg)　IL-2(μg/L)　IL-6 (pg/mL)空白對(duì)照組　10　233.67±13.86　1.07±0.17　2.81±0.23　56.17±1.96模型組　10　121.53±7.68#　4.69±0.43#　5.89±0.14#　110.90±1.81#?；撬崽幚斫M　10　199.22±5.90*　2.18±0.28*　2.97±0.13*　64.50±1.49*

2.3三組肝臟指數(shù)比較空白對(duì)照組、模型組、?；撬崽幚斫M肝臟指數(shù)分別為(2.79±0.18) %、(4.36±0.12) %、(2.85±0.15) %，模型組肝臟指數(shù)高于牛磺酸處理組、空白對(duì)照組(P均＜0.05)，?；撬崽幚斫M、空白對(duì)照組肝臟指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4小鼠肝臟組織病理檢查結(jié)果空白對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞體積較大，呈多面體形，核大而圓，核膜完整，位于細(xì)胞中央;肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，肝板間為不規(guī)則的肝竇;肝細(xì)胞連接緊密，中央靜脈和門(mén)管區(qū)無(wú)纖維增生。模型組小鼠肝小葉界限不清，胞質(zhì)內(nèi)還可見(jiàn)多個(gè)大小不等的脂肪空泡，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);肝細(xì)胞索排列紊亂，肝竇變窄;肝臟中纖維組織增生，分割包繞假小葉。?；撬崽幚斫M肝組織結(jié)構(gòu)有較明顯改善，肝細(xì)胞脂肪變性顯著減輕，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與假小葉形成;纖維沉積顯著減少。

3　討論

正常情況下，血清中HA和LN水平較低;當(dāng)肝臟功能出現(xiàn)障礙時(shí)，HA和LN的合成增加、降解相對(duì)減少，發(fā)生大量沉積，最終引起肝纖維化［4，5］。四氯化碳是肝毒性化合物，其破壞肝細(xì)胞的作用機(jī)理與氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有關(guān);脂質(zhì)過(guò)氧化能夠溶解磷脂膜，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和通透性，導(dǎo)致鈣超載;四氯化碳代謝產(chǎn)物還可以刺激肝臟枯否細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子，進(jìn)一步加重肝臟的損傷［6］。本研究采用小鼠腹腔注射四氯化碳制備肝纖維化模型，結(jié)果顯示模型組小鼠血清中HA、LN、ALT、AST、IL-2和IL-6水平升高，肝臟組織中SOD水平降低、MDA水平升高，肝臟指數(shù)增大，表明肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷。牛磺酸處理組小鼠經(jīng)?；撬崽幚?，肝細(xì)胞得到保護(hù)，肝臟纖維化得到有效控制。

?；撬崾求w內(nèi)分布廣泛、效應(yīng)多樣的自身調(diào)節(jié)物質(zhì)，它雖然不參與蛋白質(zhì)的合成，但是參與維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在抗炎、抗氧化、改善糖脂代謝和調(diào)節(jié)鈣離子等方面起著重要的作用［7］。?；撬嵩诟闻K中與膽酸結(jié)合生成?；悄懰?，能促進(jìn)脂肪乳化、增強(qiáng)脂肪酶活性，并協(xié)助膽固醇、中性脂肪、脂溶性維生素及其他脂溶性物質(zhì)的消化吸收［8］。病理切片顯示模型組肝細(xì)胞出現(xiàn)大量的空泡，呈脂肪變性，而經(jīng)?；撬崽幚砗笾咀冃燥@著減少。MDA是氧化應(yīng)激常用的標(biāo)志物，由多不飽和脂肪酸過(guò)氧化分解產(chǎn)生，常被用來(lái)間接反應(yīng)機(jī)體的自由基代謝變化及細(xì)胞的損傷程度［9］。?；撬崮軌蝻@著降低肝臟組織中MDA水平，減輕過(guò)氧化反應(yīng)，減輕MDA對(duì)機(jī)體的損傷。牛磺酸作為抗氧化劑可以通過(guò)減少活性氧的產(chǎn)生、清除活性氧和干擾活性氧的活性防止自由基損傷細(xì)胞［10］。經(jīng)牛磺酸處理后，肝臟組織中SOD水平顯著提高，使細(xì)胞中有足夠的SOD對(duì)抗過(guò)氧化反應(yīng)，清除氧自由基，保護(hù)細(xì)胞膜免受自由基的攻擊。機(jī)體內(nèi)SOD和MDA的水平能夠反映出機(jī)體清除自由基的能力和受到自由基損傷的程度。氧化應(yīng)激促進(jìn)炎癥，而炎癥反應(yīng)又加劇氧化應(yīng)激，兩者互為因果。

IL-2是調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，主要是由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，通過(guò)調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。IL-6與其他細(xì)胞因子協(xié)同作用，使肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)生持續(xù)炎癥反應(yīng)?；罨母涡菭罴?xì)胞(HSC)大量生成IL-6，而IL-6反過(guò)來(lái)刺激HSC，兩者互相作用產(chǎn)生惡性循環(huán)使得HSC呈持續(xù)活化狀態(tài)，導(dǎo)致其增殖并分泌大量的膠原。IL-6通過(guò)增加合成急性期反應(yīng)蛋白物和減少合成白蛋白，上調(diào)Ⅰ型膠原及組織金屬蛋白酶抑制物mRNA的轉(zhuǎn)錄，抑制金屬蛋白酶的釋放，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展［11］。本研究顯示，模型組血清中IL-2、IL-6水平升高，且肝細(xì)胞出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);?；撬崽幚斫M血清中IL-2、IL-6水平降低。與模型組比較，?；撬崽幚斫M肝組織結(jié)構(gòu)明顯改善，肝細(xì)胞脂肪變性顯著減輕，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與假小葉形成，纖維沉積顯著減少。因此認(rèn)為?；撬崮軌驕p少肝內(nèi)炎性反應(yīng)，減輕肝細(xì)胞的免疫損傷。

綜上所述，牛磺酸可以調(diào)節(jié)肝臟脂肪代謝，清除氧自由基，增加機(jī)體抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力，抑制炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定細(xì)胞膜通透性，減少膠原的產(chǎn)生和沉積，最終抑制肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

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Inhibitory effect of taurine on liver fibrosis in mice

LIU Hong1，GAO Yuan-zhi，TIAN Jing-jing，WANG Xue-liang，BAI Jian
(1 Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China)

Abstract:Objective To observe the changes of liver injury，fibrosis，oxidative stress and inflammation indexes before and after treatment of taurine in carbon tetrachloride-induced liver fibrosis of mice，and to investigate the inhibitory effect of taurine on liver fibrosis in mice.Methods Thirty mice were randomly divided into three groups including blank control group，model group and taurine treatment group，10 mice in each group.Mice in the model and taurine treatment groups were injected carbon tetrachloride in enterocoelia to build the liver fibrosis model.At the same time，mice in the taurine treatment group were fed by taurine in drinking water.After 10 weeks，peripheral blood and serum were collected.Hyaluronic acid (HA)，layer adhesion protein (LN)，alanine aminotransferase (ALT)，aspartate aminotransferase (AST)，interleukin 2 (IL-2) and IL-6 in the serum were detected.The liver index was calculated; the super oxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) level in the liver tissues was detected; and pathological changes of liver tissues were stained by HE and Masson.Results Compared with the model group，HA，LN，ALT，AST，IL-2 and IL-6 levels in the serum were decreased in the taurine treatment group (all P＜0.05) ; and SOD in the liver tissue was increased，MDA level，liver indexes were decreased in the liver tissues (all P＜0.05).The pathological examination showed that the inflammatory infiltrates in the liver tissue and fat cavitation significantly reduced and fibrous tissue deposition could not be found.ConclusionTaurine has a certain inhibitory effect on carbon tetrachloride induced liver fibrosis in mice.

Key words:liver fibrosis，mice; taurine; hyaluronic acid; layer adhesion protein; super oxide dismutase; malondialdehyde; interleukin 2; interleukin 6

(收稿日期:2015-03-31)

通信作者簡(jiǎn)介:白劍(1979-)，男，實(shí)驗(yàn)師，主要從事肝臟纖維化研究。E-mail: baijian988@ hotmail.com

作者簡(jiǎn)介:第一劉鴻(1986-)，男，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事牛磺酸生物學(xué)功能的研究。E-mail: 710301527@ qq.com

基金項(xiàng)目:遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(201101142) ;遼寧省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)計(jì)劃(2012225018)。

文章編號(hào):1002-266X(2015)21-0017-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類(lèi)號(hào):R575; R-332

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.006