李婷，張大啟，楊春生，翟翬

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052)

視神經(jīng)脊髓炎(NMO)是視神經(jīng)和脊髓同時(shí)或相繼受累的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病。自2004年Lennon等［1］利用間接熒光免疫法(IIF)在NMO患者血清中發(fā)現(xiàn)了水通道蛋白4(AQP4)抗體以來(lái)，諸多研究表明，NMO是一類有別于多發(fā)性硬化(MS)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘性疾病單元，并稱之為視神經(jīng)脊髓炎疾病譜(NMOSD)［2］。目前在 NMOSD臨床診斷和研究中血清AQP4抗體檢測(cè)多為定性測(cè)定，而定量檢測(cè)較少。本研究利用熒光免疫沉淀(FIPA)法檢測(cè)75例中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病患者血清 AQP4 抗體［3～5］，并分析血清 AQP4 抗體水平與NMOSD臨床特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年7月～2014年8月天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的75例中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病患者。患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)及臨床相關(guān)信息均被收集并錄入中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病數(shù)據(jù)庫(kù)。NMOSD患者55例［男9例、女46例，年齡(43.1 ±1.9)歲，病程(3.6 ±0.8)年，脊髓受累節(jié)段數(shù)(5.6±0.5)個(gè)，首次發(fā)病擴(kuò)展殘疾狀況評(píng)分量表(EDSS)評(píng)分(4.8 ±0.8)分，2 年內(nèi)復(fù)發(fā)(1.7 ±0.1)次］，其中NMO患者13例、復(fù)發(fā)性長(zhǎng)節(jié)段橫貫性脊髓炎(LETM)患者30例、復(fù)發(fā)性視神經(jīng)炎(ON)患者12例，均符合2006年Wingerchuk等［2］修訂的NMO及其疾病譜診斷標(biāo)準(zhǔn);MS患者20例［男6例、女14例，年齡(33.9 ±3.9)歲，病程(4.0±0.9)年，脊髓受累節(jié)段數(shù)(1.9 ±0.1)個(gè)，首次發(fā)病 EDSS評(píng)分(1.8±0.7)分，2年內(nèi)復(fù)發(fā)(1.4±0.4)次］，均符合 2005 年MS 診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。以上疾病均由3名有豐富神經(jīng)免疫疾病臨床經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師共同診斷，EDSS由已獲得EDSS評(píng)分國(guó)際資格認(rèn)證的醫(yī)師評(píng)價(jià)。此外，尚有陽(yáng)性對(duì)照組(PC)2例，血清由英國(guó)牛津大學(xué)臨床神經(jīng)科實(shí)驗(yàn)室提供;疾病對(duì)照組(OND)10例，重癥肌無(wú)力和吉蘭巴雷綜合征各5例;健康對(duì)照組(HC)10例，來(lái)源于我院健康體檢中心。

1.2 血清AQP4抗體測(cè)定 采集靜脈血，分離血清凍存于 -80 ℃。參照文獻(xiàn)［3～5］方法，采用 FIPA 法檢測(cè)血清AQP4抗體。EGFP標(biāo)記的人AQP4 cDNA質(zhì)粒和EGFP cDNA質(zhì)粒由英國(guó)牛津大學(xué)臨床神經(jīng)科惠贈(zèng)。解凍待測(cè)組血清，4℃、10000 r/min離心5 min，取上清 5 μL 和 10 μL，分別加入 50 μL EGFPAQP4抗原提取液，混合后4℃輪轉(zhuǎn)過(guò)夜，然后加入適量非特異山羊抗人 IgG，4℃孵育2 h，10000 r/min離心3 min，棄上清，收集沉淀，最后用1 mL裂解提取緩沖液漂洗沉淀，重復(fù)3次;將沉淀移入96孔板中，在高速多通道連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀上獲取熒光吸光度，以健康對(duì)照組熒光均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差以上為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，每份血清檢測(cè)均雙盲，并重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism5.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖及統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)性數(shù)據(jù)采用Spearman相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

NMOSD患者中FIPA陽(yáng)性42例，NMO患者中FIPA陽(yáng)性11例，LETM患者中FIPA陽(yáng)性23例，ON患者中FIPA陽(yáng)性8例，MS患者中FIPA陽(yáng)性0例。在NMO和LETM抗體陽(yáng)性患者中，AQP4抗體FU值與脊髓受累長(zhǎng)度呈正相關(guān)(rs=0.188，P=0.012)。在血清 AQP4抗體陽(yáng)性的 NMOSD患者中，AQP4抗體FU值與首次發(fā)病2年內(nèi)復(fù)發(fā)次數(shù)均無(wú)相關(guān)性。4例血清AQP4抗體陽(yáng)性的NMOSD患者經(jīng)甲強(qiáng)龍沖擊、強(qiáng)的松和(或)硫唑嘌呤等免疫抑制劑治療后，半個(gè)月至5個(gè)月患者血清AQP4抗體逐漸轉(zhuǎn)為陰性。

3 討論

NMO是一類以體液免疫為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘性疾病，臨床癥狀重，病程長(zhǎng)，致殘率高，對(duì)免疫抑制劑治療效果較好。研究［7］認(rèn)為，NMO是以AQP4為靶抗原的自身免疫性疾病，對(duì)此類患者早期進(jìn)行血清AQP4抗體檢測(cè)，有助于該病的早期診斷治療、復(fù)發(fā)預(yù)防及預(yù)后改善。目前國(guó)外多家神經(jīng)免疫中心已建立起多種可用于檢測(cè)血清AQP4抗體敏感性、特異性均較高的臨床檢測(cè)方法。自2004年Lennon等［1］利用 IIF法在 NMO患者血清中發(fā)現(xiàn)AQP4抗體以來(lái)，用于檢測(cè)血清AQP4抗體的方法至少有20種，但得到廣泛認(rèn)可的是日本Takahashi等［3，4］和英國(guó) Waters等［5］為提高 AQP4 抗體檢測(cè)敏感性和特異性，率先建立的CBA法與FIPA法。其中，CBA法是在細(xì)胞表面進(jìn)行觀測(cè)，為定性檢測(cè);而FIPA法可定量測(cè)定AQP4抗體滴度。為建立可用于臨床、定性定量檢測(cè)血清AQP4抗體的方法并進(jìn)一步評(píng)估AQP4抗體的臨床意義，我們利用FIPA法對(duì)75例中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病患者進(jìn)行了血清AQP4抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示FIPA法檢測(cè)NMOSD患者血清 AQP4抗體敏感性為 76.4%，特異性為100%，與國(guó)外 Waters等［5］報(bào)道大致相符，與 CBA相比，F(xiàn)IPA敏感性雖略低，但操作簡(jiǎn)單，可進(jìn)行大樣本、批量檢測(cè)。

本研究發(fā)現(xiàn)在AQP4抗體陽(yáng)性的NMOSD患者中，AQP4抗體FU值與患者脊髓受累長(zhǎng)度呈正相關(guān);對(duì)4例AQP4抗體陽(yáng)性的患者抗體水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，患者在急性期甲強(qiáng)龍沖擊、緩解期強(qiáng)的松和/或硫唑嘌呤治療后，0.5～5個(gè)月患者血清AQP4抗體較為陰性。這與及Weinshenker［8］報(bào)道結(jié)果一致，提示NMOSD患者血清AQP4抗體FU值或抗體滴度水平可反映疾病是否處于急性期或再次復(fù)發(fā)，并可評(píng)估治療效果。而血清AQP4抗體FU值與首次發(fā)病2年復(fù)發(fā)率及EDSS評(píng)分無(wú)相關(guān)性，這似乎與AQP4抗體為NMO致病性抗體相悖，考慮到EDSS主要適用于MS，提示臨床需建立更適用于NMO疾病的病情評(píng)估系統(tǒng)。

綜上所述，血清AQP4抗體檢測(cè)可作為NMO與NVS鑒別的特異性血清學(xué)指標(biāo)，血清AQP4抗體水平可判斷疾病是否復(fù)發(fā)及評(píng)估治療效果。

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