王玉霞，孔紅霞，韓貝貝，陳雁南，劉燕(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

VASH1和VEGFR-2在宮頸鱗癌組織的表達(dá)及意義

王玉霞，孔紅霞，韓貝貝，陳雁南，劉燕
(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

摘要:目的探討血管生成抑制蛋白1(VASH1)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2(VEGFR-2)在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及意義。方法選取20例正常宮頸組織、25例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)組織、45例宮頸鱗癌組織，采用免疫組化SP法和熒光定量PCR法分別檢測(cè)VASH1和VEGFR-2的表達(dá)。結(jié)果宮頸鱗癌組織中VASH1、VEGFR-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于CIN組織、正常宮頸組織(P均＜0.05)。VASH1 mRNA、VEGFR-2 mRNA在宮頸鱗癌組織中的相對(duì)表達(dá)量均高于CIN組織及正常宮頸組織(P均＜0.05)。VASH1的表達(dá)與宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P均＜0.05)，VEGFR-2的表達(dá)與宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及組織病理學(xué)分級(jí)有關(guān)(P均＜0.05)。宮頸鱗癌組織中VASH1與VEGFR-2的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.617，P＜0.01)。結(jié)論宮頸鱗癌組織中VASH1、VEGFR-2高表達(dá)，二者的表達(dá)變化可能與宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

關(guān)鍵詞:宮頸腫瘤;腫瘤，鱗狀細(xì)胞;血管生成抑制蛋白;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體

新生血管在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為腫瘤供應(yīng)所需營(yíng)養(yǎng)，并為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供了通道［1］。因此，抗腫瘤血管生成成為研究腫瘤治療方法的一個(gè)重要方向。血管生成抑制蛋白1(VASH1)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種以負(fù)反饋調(diào)節(jié)為主的血管生成抑制蛋白，主要來(lái)源于血管內(nèi)皮細(xì)胞。VASH1主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)誘導(dǎo)，VEGF與其受體VEGFR-2結(jié)合后啟動(dòng)下游PKC-δ信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞VASH1的表達(dá)。VASH1對(duì)腫瘤血管新生發(fā)揮著至關(guān)重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，主要抑制新生血管的發(fā)芽時(shí)期，可在體內(nèi)外明顯抑制腫瘤的發(fā)展［2］。本研究觀察了VASH1 和VEGFR-2在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)變化，并探討二者在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集2013年9月～2014年11月本院手術(shù)切除宮頸組織標(biāo)本90例，經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)正常宮頸組織20例(患者年齡32～67歲、平均45.6歲)、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)組織25例(患者年齡30～64歲、平均42.2歲)、宮頸鱗癌組織45例(患者年齡30～70歲、平均46.1歲)。三類患者年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)前均無(wú)放療、化療及免疫治療史。

1.2宮頸組織中VASH1、VEGFR-2蛋白表達(dá)檢測(cè)宮頸組織切除后一部分甲醛固定、石蠟包埋、4 μm厚度常規(guī)切片，另一部分快速置于液氮中－80℃保存。采用免疫組化SP法，取切片嚴(yán)格遵循試劑盒說(shuō)明書(shū)采用二步反應(yīng)法進(jìn)行染色，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。每張切片至少觀察5個(gè)高倍鏡下視野，鏡下細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜顯示棕黃色或棕褐色判定細(xì)胞陽(yáng)性。細(xì)胞染色無(wú)色計(jì)0分，輕度著色1分，中度著色2分，重度著色3分;陽(yáng)性細(xì)胞百分比＞50%計(jì)3分，26% ～50%計(jì)2分，5%～25%計(jì)1分，＜5%計(jì)0分;兩種評(píng)分乘積＞3為陽(yáng)性，≤3為陰性。

1.3宮頸組織中VASH1 mRNA、VEGFR-2 mRNA表達(dá)檢測(cè)采用熒光定量PCR技術(shù)。按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取宮頸組織總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度及純度，遵照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。VASH1上游引物5'-GAACTACTTCCGCCACATCG-3'，下游引物5'-CCAGCTTCACCTTCTTGAGC-3'; VEGFR-2上游引物5'-TTACTTGCAGGGGACAGAGG-3'，下游引物5'-TTCCCGGTAGAAGCAC TTGT-3'; GAPDH(內(nèi)參)上游引物5'-AGAAGGCTGGGG CTCATTTG-3'，下游引物5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。PCR反應(yīng)體系: 2 ×UItraSYBR Mixture 10 μL，上游、下游引物各0.8 μL，cDNA 1 μL，RNase-Free Water 7.4 μL總反應(yīng)體系為20 μL。PCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火/延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析: 95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s，60℃、15 s。采用ABI7500熒光定量PCR儀，Ct值代表每個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值所需的循環(huán)數(shù)，Ct值與目的基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。用2－ΔΔCt相對(duì)定量法分析目的基因(VASH1、VEGFR-2)的表達(dá)情況［3］，ΔCt=目的基因Ct－內(nèi)參基因Ct，ΔΔCt=目的基因ΔCt－標(biāo)準(zhǔn)值ΔCt，目的基因的相對(duì)表達(dá)量即為2－ΔΔCt。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)。陽(yáng)性表達(dá)率以百分比表示，2ΔΔCt以相對(duì)比［M(95% CI)］表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析VASH1與VEGFR-2表達(dá)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三種宮頸組織VASH1、VEGFR-2蛋白表達(dá)比較VASH1蛋白在正常宮頸組織、CIN組織及宮頸鱗癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為15.0% (3/20)、44.0% (11/25)及75.6%(34/45)，VEGFR-2分別為10.0% (2/20)、40.0%(10/25)、66.7%(30/45) ;宮頸鱗癌組織中VASH1、VEGFR-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于CIN組織、正常宮頸組織(P均＜0.05)。

2.2三種宮頸組織VASH1 mRNA、VEGFR-2 mRNA的表達(dá)比較VASH1和VEGFR-2 mRNA在宮頸鱗癌組織中的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于CIN組織及正常宮頸組織(P均＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3VASH1 mRNA和VEGFR-2 mRNA表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系VASH1 mRNA表達(dá)與宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P均＜0.05)，與年齡、組織病理學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)(P均＞0.05) ; VEGFR-2 mRNA表達(dá)與宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及組織病理學(xué)分級(jí)有關(guān)(P均＜0.05)，而與年齡無(wú)關(guān)(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

2.4VASH1mRNA與VEGFR-2mRNA表達(dá)的相關(guān)

3　討論

VASH1基因定位于染色體14q24.3，包含7個(gè)內(nèi)含子及8個(gè)外顯子，由365個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成［4］。Ito等［5］研究發(fā)現(xiàn)接種過(guò)Lewis肺癌細(xì)胞的小鼠中，缺乏VASH1基因的小鼠肺部和腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移量明顯升高，表明VASH1有一定的抗腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作用。Zhang等［6］研究結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌組織中VASH1陽(yáng)性表達(dá)率為63.1%，高于癌旁組織(21.4%)，且隨腫瘤臨床分期的增高、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，VASH1的陽(yáng)性表達(dá)率升高。Yoshinaga等［7］研究結(jié)果顯示VASH1在宮頸鱗癌和腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常宮頸組織，認(rèn)為VASH1在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能對(duì)新生血管有抑制作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，VASH1在胃癌［8］、前列腺癌［9］、子宮內(nèi)膜癌［10］、食管癌［11］等惡性腫瘤中高表達(dá)。本研究采用免疫組化染色法及熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)VASH1在不同宮頸組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示宮頸鱗癌組織中VASH1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率、VASH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于CIN組織、正常宮頸組織(P均＜0.05)。且VASH1的表達(dá)與宮頸鱗癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與Yoshinaga等［7］的研究結(jié)果相符，提示VASH1可能在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中抑制了新生血管生成。

VEGFR-2是VEGF的主要功能受體，其與VEGF結(jié)合后，主要在生理病理情況下介導(dǎo)新生血管的形成［12］。VEGFR-2基因位于人染色體4q 31.2-32，由7個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域組成的胞外區(qū)、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)及胞質(zhì)內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)區(qū)構(gòu)成［13］。VEGF/VEGFR-2介導(dǎo)的信號(hào)通路可調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和通透性，進(jìn)而促進(jìn)血管生成［12］。丁曼華等［14］利用免疫組化法檢測(cè)到非小細(xì)胞肺癌組織中VEGFR-2的陽(yáng)性率為57.5%，顯著高于肺部良性病變組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;且VEGFR-2的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌臨床分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。Kopparapu等［15］的研究結(jié)果顯示VEGFR-2在171例膀胱癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，認(rèn)為VEGFR-2可能參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。眾多研究［16，17］發(fā)現(xiàn)VEGFR-2在多種腫瘤如胃癌、結(jié)直腸癌、白血病、乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌中過(guò)表達(dá)，提示VEGFR-2可能與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，宮頸鱗癌組織中VEGFR-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率、VEGFR-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于CIN組織、正常宮頸組織，且VEGFR-2的表達(dá)與宮頸鱗癌臨床分期、組織病理學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說(shuō)明VEGFR-2的高表達(dá)可能與宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

本研究中VASH1和VEGFR-2在宮頸鱗癌組織中均高表達(dá)，且二者呈正相關(guān)，提示VASH1、VEGFR-2與宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。VASH1可抑制腫瘤血管和淋巴管的新生，有望成為宮頸鱗癌及更多惡性腫瘤抗血管生成治療的新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn):

［1］許成云，倪慶桂，張陸勇.腫瘤微環(huán)境與腫瘤血管新生［J］.中國(guó)醫(yī)療前沿，2009，4(4) : 21-24.

［2］Kern J，Steurer M，Gastl G，et al.Vasohibin inhibits angiogenic sprouting in vitro and supports vascular maturation processes in vivo ［J］.BMC Cancer，2009，17(9) : 284-294.

［3］陳琳，王峰，吳月平，等.蛋白酶活化受體-4在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及意義［J］.山東醫(yī)藥，2011，51(7) : 43-44.

［4］Sato Y.The vasohibin family: a novel family for angiogenesis regulation［J］.J Biochem，2013，153 (1) : 5-11.

［5］Ito S，Miyashita H，Suzuki Y，et al.Enhanced cancer metastasis in mice deficient in Vasohibin-1 gene［J］.PLoS One，2013，8 (9) : 73931-73940.

［6］Zhang T，Yu TT，Zhang DM，et al.Vasohibin-1 expression detected by immunohistochemistry correlates with prognosis in non-small cell lung cancer［J］.Med Oncol，2014，31(5) : 963-968.

［7］Yoshinaga K，Ito K，Moriya T，et al.Roles of intrinsic angiogenesis inhibitor，vasohibin，in cervical carcinomas［J］.Cancer Sci，2011，102 (2) : 446-451.

［8］Shen Z，Kauttu T，Sep?anen H，et al.Vasohibin-1 and vasohibin-2 expression in gastric cancer cells and TAMs［J］.Med Oncol，2012，29(4) : 2718-2726.

［9］Kosaka T，Miyazaki Y，Miyajima A，et al.The prognostic significance of vasohibin-1 expression in patients with prostate cancer ［J］.Br J Cancer，2013，108(10) : 2123-2129.

［10］Yoshinaga K，Ito K，Moriya T，et al.Expression of vasohibin as a novel endothelium-derived angiogenesis inhibitor in endometrial cancer［J］.Cancer Science，2008，99(5) : 914-919.

［11］郭曉峰，楊鯤鵬，葛曉晴，等.食管鱗狀細(xì)胞癌組織中VASH1蛋白的表達(dá)［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49(2) : 150-153.

［12］F de Castro L，Maycas M，Bravo B，et al.VEGF receptor2(VEGFR2) activation is essential for osteocyte survival induced by mechanotransduction［J］.J Cell Physiol，2014，230(2) : 278-285.

［13］Lin YF，Chang CC，Lin SH，et al.inverse correlation of phospho-KDR/Flk-1 expression and stage of colorectal cancer: implication of the significance of neoangiogenesis in activated VEGFR-2 expressing early stage colorectal adenocarcinomas［J］.Pol J Pathol，2014，65(3) : 194-201.

［14］丁曼華，劉亮，劉毅，等.人非小細(xì)胞肺癌VEGFR2和NRP-1表達(dá)意義分析［J］.中華腫瘤防治雜志，2014，21(11) : 841-846.

［15］Kopparapu PK，Boorjian SA，Robinson BD，et al.Expression of VEGF and its receptors VEGFR1/VEGFR2 is associated with invasiveness of bladder cancer［J］.Anticancer Res，2013，33 (6) : 2381-2390.

［16］Zhang H，Wu J，Meng L，et al.Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors KDR and Flt-1 in gastric cancer cells ［J］.World J Gastroenterology，2002，8(6) : 994-998.

［17］Slattery ML，Lundgreen A，Wolff RK.VEGFA，F(xiàn)LT1，KDR and colorectal cancer: assessment of disease risk，tumor molecular phenotype，and survival［J］.Mol Carcinog，2014，53(1) : 140-150.

(收稿日期:2014-12-21)

通信作者:孔紅霞

文章編號(hào):1002-266X(2015)21-0040-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號(hào):R587.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.015