劉榮泉，傅奕，鄭英，陳浮，徐曉鈴，喬敏，朱海杭(揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，揚州蘇北人民醫(yī)院，江蘇揚州500;揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

非糜爛性反流病患者食管上皮細(xì)胞鈣黏蛋白的表達(dá)及細(xì)胞間隙的改變

劉榮泉1，傅奕2，鄭英2，陳浮1，徐曉鈴1，喬敏1，朱海杭1
(1揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，揚州蘇北人民醫(yī)院，江蘇揚州225001;2揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

摘要:目的探討非糜爛性反流病(NERD)患者食管上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)變化及細(xì)胞間隙的改變。方法采用免疫組化染色法檢測43例份NERD食管下段上皮組織與26例正常食管下段上皮組織中的E-cadherin，在光鏡下觀察切片并采集圖像，采用圖像分析系統(tǒng)測量細(xì)胞間隙。結(jié)果E-cadherin在NERD食管上皮組織中異常表達(dá)36例(失表達(dá)4例、不完整性表達(dá)32例)，異常表達(dá)率83.7%;在正常食管上皮組織中異常表達(dá)5 例(失表達(dá)0例、不完整性表達(dá)5例)，異常表達(dá)率19.2%;二者相比，P＜0.01。NERD患者食管鱗狀上皮細(xì)胞間隙［(1.23±0.04)μm］大于正常食管鱗狀上皮細(xì)胞間隙［(0.68±0.06)μm］，二者相比，P＜0.01。結(jié)論E-cadherin 在NERD患者食管上皮組織中低表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞間隙增寬，可能是NERD發(fā)病的機制之一。

關(guān)鍵詞:胃食管反流;上皮細(xì)胞鈣黏蛋白;細(xì)胞間隙;免疫組織化學(xué)

非糜爛性反流病(NERD)是指具有反流癥狀，而內(nèi)鏡下沒有食管黏膜異常表現(xiàn)的一種常見慢性病。美國一項互聯(lián)網(wǎng)調(diào)查的流行病學(xué)資料顯示，成年人胃食管反流病(GERD)發(fā)病率達(dá)26%，而NERD占GERD的70%左右［1］。NERD的發(fā)生與抗反流屏障功能失調(diào)有關(guān)，包括下食管括約肌松弛、食管內(nèi)反流物清除障礙、食管黏膜防御能力下降等。上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)為細(xì)胞間連接的重要組成部分，與緊密連接蛋白(TJ)相連，共同維持細(xì)胞功能［2，3］。食管鱗狀上皮細(xì)胞間隙增寬是NERD的早期形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，可為正常人細(xì)胞間隙的2～3倍。本文對NERD患者食管上皮組織中E-cadherin的表達(dá)變化及鱗狀上皮細(xì)胞間隙的改變進(jìn)行研究，以探討其與NERD的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料2013年3～9月蘇北人民醫(yī)院收治的有反流、胸痛等癥狀的患者43例，均經(jīng)胃鏡及病理學(xué)檢查診斷為NERD。其中，男25例、女18例，年齡25～77(52.2±13.4)歲。另選擇無反流癥狀非GERD者26例作對照，男13例、女13例，年齡35～65(51.8±9.4)歲。均在距離食管下端3～5 cm處取上皮組織標(biāo)本活檢。

1.2E-cadherin檢測采用免疫組織化學(xué)染色En-Vision法(二步法)。組織標(biāo)本用10%甲醛固定24 h，石蠟包埋、切片、脫蠟，梯度乙醇至水，PBS(pH 7.4)沖洗3次，微波法熱抗原修復(fù)，檸檬酸(pH 6)緩沖液，3% H2O2去離子水37℃孵育10 min。PBS沖洗3次，除去PBS液，每張切片加1滴E-cadherin抗體(博士)，冰箱4℃過夜，PBS沖洗3次，除去PBS液，每張切片加1滴E-cadherin Anti-Rabbit IgG，溫箱37℃孵育60 min，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加2滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察1～3 min。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染1 min，自來水沖洗返藍(lán)。切片經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察其表達(dá)部位及類型。結(jié)果判斷: E-cadherin正常表達(dá)于上皮細(xì)胞，呈完整的胞膜表達(dá);鏡下見棕黃色顆粒狀為其表達(dá)陽性，以染色強度分別計0～3分(無染色計0分、輕度染色計1分、中等染色計2分、強染色計3分)，再以細(xì)胞膜完整表達(dá)、不完整表達(dá)＜50%、不完整表達(dá)≥50%、失表達(dá)分別計3、2、1、0分，兩項得分相加，0分為失表達(dá)，1～3分為不完整性表達(dá)，4～6分為完整性表達(dá)，失表達(dá)與不完整性表達(dá)為E-cadherin異常表達(dá)。

1.3細(xì)胞間隙測量另取切片行HE染色后，選取基底上層或棘層的細(xì)胞核居中、核仁明顯的細(xì)胞，光鏡(×400)觀察并采集圖像。采用盲法對每例切片隨機選擇10個不同視野共取10張照片，采用IPP圖像分析系統(tǒng)每張相片測量10個細(xì)胞間隙，計算測量得到的100個細(xì)胞間隙的平均值，然后計算平均值。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料用珋x±s表示，比較采用t檢驗;計數(shù)資料以百分比表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1E-cadherin在NERD食管上皮組織與正常食管上皮組織中的表達(dá)比較E-cadherin在NERD食管上皮組織中異常表達(dá)36例(失表達(dá)4例、不完整性表達(dá)32例)，異常表達(dá)率83.7%;在正常食管上皮組織中異常表達(dá)5例(失表達(dá)0例、不完整性表達(dá)5例)，異常表達(dá)率19.2%;二者相比，P＜0.01。

2.2NERD食管鱗狀上皮與正常食管鱗狀上皮細(xì)胞間隙比較NERD食管鱗狀上皮細(xì)胞間隙為(1.23±0.04)μm，正常食管鱗狀上皮細(xì)胞間隙為(0.68±0.06)μm，二者相比，P＜0.01。

3　討論

食管黏膜防御主要為上皮屏障，由細(xì)胞膜、橋粒蛋白(DP)和TJ組成，TJ由跨膜蛋白、胞質(zhì)附著蛋白、細(xì)胞骨架蛋白相連組成［4］。E-cadherin是鈣依賴性黏附蛋白家族中的重要成員，是黏著連接的一個組成部分，與TJ、DP共同維持細(xì)胞屏障;其基因位于第16號染色體長臂，為跨膜黏蛋白，其羧基末端駐留在細(xì)胞質(zhì)中，而氨基末端位于細(xì)胞間隙，在Ca2+參與下通過胞質(zhì)連環(huán)素與細(xì)胞骨架蛋白相連，介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附作用;在建立和維持上皮組織細(xì)胞間連接阻力及滲透性中起主要作用［5］。Jovov等［5］研究發(fā)現(xiàn)，缺乏E-cadherin蛋白的白鼠模型中食管黏膜存在細(xì)胞間隙增寬，說明E-cadherin蛋白與食管黏膜的細(xì)胞間隙增寬有一定關(guān)系。

在病理情況下，如炎性因子作用，酸堿、膽汁刺激等，可引起食管上皮E-cadherin分布異常、表達(dá)減少甚至溶解，影響其功能，破壞上皮細(xì)胞間的極性和完整性，細(xì)胞間的黏附作用減弱或消失，導(dǎo)致細(xì)胞間隙增寬，進(jìn)而使內(nèi)皮層通透性升高［6］。反流性食管炎和NERD食管黏膜細(xì)胞間隙都存在增寬［7］，其通透性增大［8］。有研究認(rèn)為上皮細(xì)胞間隙增寬是NERD的客觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)［9］。經(jīng)質(zhì)子泵抑制劑治療后，NERD食管黏膜上皮細(xì)胞間隙可恢復(fù)正常［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照者相比，NERD食管上皮組織中E-cadherin異常表達(dá)率高，為蛋白量下降或失表達(dá)所致，這與國外報道［5］結(jié)果相符;且細(xì)胞間隙增寬明顯，與正常對照者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，從分子學(xué)基礎(chǔ)上可以認(rèn)為NERD發(fā)病與E-cadherin的異常表達(dá)有關(guān)。從本研究結(jié)果來看，NERD患者由于E-cadherin表達(dá)異常，導(dǎo)致細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)和功能異常，細(xì)胞間隙增寬，使得黏膜通透性升高，H+、胃蛋白酶、膽汁酸等易透過上皮層，作用于黏膜下的神經(jīng)末梢，從而引起燒心、反酸、胸痛等癥狀。因此，NERD的發(fā)生可能與E-cadherin表達(dá)異常，使得細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞間通透性增高有關(guān)。

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·綜述·

(收稿日期:2014-09-25)

文章編號:1002-266X(2015) 21-0088-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號:R571

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.036