鄧娜，婁曄，于藝冰，王曉鷗，樊華(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，沈陽00; 大慶市油田總醫(yī)院; 秦皇島市第一醫(yī)院)

急性髓系白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCF表達(dá)變化及意義

鄧娜1，婁曄2，于藝冰3，王曉鷗1，樊華1
(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，沈陽110032; 2大慶市油田總醫(yī)院; 3秦皇島市第一醫(yī)院)

摘要:目的觀察急性髓系白血病(AML)患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞范可尼貧血蛋白FANCF的表達(dá)變化，并探討其對(duì)療效的判斷價(jià)值。方法選擇同期接受治療的AML患者111例(觀察組)及性別、年齡匹配的非AML患者42 例(對(duì)照組)。采用密度梯度法提取兩組骨髓單個(gè)核細(xì)胞，免疫熒光法檢測(cè)其FANCF表達(dá)。結(jié)果觀察組骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCF陽性表達(dá)45例(40.5%)，對(duì)照組為40例(95.2%)，P＜0.01。觀察組中，64例初診患者單個(gè)核細(xì)胞FANCF陽性表達(dá)14例(21.8%)，27例經(jīng)過化療后完全緩解(CR)者26例(96.3%)，20例復(fù)發(fā)者中5例(25.0%) ; CR患者單個(gè)核細(xì)胞FANCF陽性表達(dá)率均高于初診和復(fù)發(fā)患者，P均＜0.01;初診和復(fù)發(fā)患者比較、CR患者和對(duì)照組比較，P均＞0.05。結(jié)論AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCF表達(dá)降低，F(xiàn)ANCF檢測(cè)有助于AML的療效評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞:急性髓系白血病;范可尼貧血蛋白;骨髓單個(gè)核細(xì)胞

范可尼貧血(FA)是一種常染色體隱性遺傳病，此類患者易患急性髓系白血病(AML)［1］、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、婦科癌癥等［2］。目前，已發(fā)現(xiàn)至少15種FA蛋白［3～5］通過共同途徑組成一個(gè)多蛋白核心復(fù)合物，其穩(wěn)定性直接影響下游FA-BRCA途徑發(fā)揮DNA修復(fù)作用［6，7］。FANCF是其中一種FA蛋白，通過FA通路參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄與基因穩(wěn)定性等多種生命信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控［8，9］。在多種實(shí)體腫瘤中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCF表達(dá)降低或功能缺失與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［10～12］，而關(guān)于FANCF是否參與AML的發(fā)生及其調(diào)控機(jī)制尚未見報(bào)道。因此，我們觀察了AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCF蛋白的表達(dá)變化，并探討其意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料2006年9月～2014年7月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院血液科就診的AML患者111例(觀察組)，均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中的AML診斷標(biāo)準(zhǔn)［13］。其中，男62例、女49例，中位年齡56歲;初診64例，經(jīng)過化療后完全緩解(CR) 27例，復(fù)發(fā)20例。選擇同期性別、年齡匹配的非AML患者42例(對(duì)照組)，其中巨幼細(xì)胞貧血16例、腎性貧血10例、缺鐵性貧血5例、血小板減少性紫癜11例。

1.2方法

1.2.1骨髓單個(gè)核細(xì)胞提取采用密度梯度法。兩組均行骨髓穿刺術(shù)，抽取骨髓液3～5 mL，肝素抗凝，緩慢注入4 mL淋巴細(xì)胞分離液。2 100 r/min離心20 min，取中間細(xì)胞層，PBS洗滌; 1 500 r/min離心5 min，棄上清;加入蒸餾水2 mL，破壞紅細(xì)胞1 min;加入1.8% NaCl 2 mL，1 500 r/min離心5 min。棄上清液，沉淀即為分離的有核細(xì)胞，用PBS按105/片稀釋。離心甩片機(jī)每孔滴加50 μL的PBS混懸液，甩片4張，離心后自然干燥待用。

1.2.2骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCF檢測(cè)采用免疫熒光法。取單個(gè)核細(xì)胞甩片，置于室溫孵育30 min，滴加多聚甲醛固定5 min，PBS沖洗; 0.2% Triton X-100通透10 min，PBS沖洗;山羊血清封閉15 min，加入兔抗人FANCF蛋白一抗25 μL，放濕盒置4℃過夜。PBS沖洗，加入熒光FITC標(biāo)記二抗，37℃避光孵育30 min，自來水沖洗終止反應(yīng)。熒光顯微鏡觀察，胞質(zhì)中呈現(xiàn)綠色熒光表明FANCF蛋白染色陽性;鏡下隨機(jī)觀察100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。其中，陽性細(xì)胞百分比≤5%為0分，5%～24% 為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分:極弱的可疑熒光為0分，熒光較弱、僅能見明確可見的熒光為1分，黃綠色明亮熒光為2分，亮綠色耀眼熒光為3分。以陽性細(xì)胞百分比評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分表示，0為FANCF表達(dá)陰性，≥1為陽性。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

觀察組骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCF陽性表達(dá)45例(40.5%)，對(duì)照組為40例(95.2%) ;兩組骨髓單個(gè)核細(xì)胞ANCF陽性率比較，P＜0.01。觀察組中，初診患者單個(gè)核細(xì)胞FANCF陽性表達(dá)14例(21.8%)，CR患者中26例(96.3%)，復(fù)發(fā)患者中5 例(25.0%) ; CR患者單個(gè)核細(xì)胞FANCF陽性表達(dá)率高于初診和復(fù)發(fā)患者，P均＜0.01;初診和復(fù)發(fā)患者比較，CR患者和對(duì)照組比較，P均＞0.05。

3　討論

目前，F(xiàn)A途徑已發(fā)現(xiàn)至少15種基因編碼的15 個(gè)FA蛋白，它們通過共同途徑組成一個(gè)多蛋白核心復(fù)合物。首先，F(xiàn)ANCA、FANCB、FANCC、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL和FANCM在細(xì)胞核內(nèi)聚合，形成上游的E3泛素化連接酶復(fù)合體;其中，F(xiàn)ANCA與FANCG、FANCB與FANCL在胞質(zhì)中各自形成亞復(fù)合體，進(jìn)入胞核內(nèi)與FANCM作用，再與已在胞核內(nèi)形成的FANCC和FANCE亞復(fù)合體相互作用。其中，F(xiàn)ANCF使復(fù)合體更穩(wěn)定，在FA通路中發(fā)揮重要作用。

FANCF基因位于11號(hào)染色體短臂的15號(hào)位點(diǎn)，其編碼的蛋白與原核RNA結(jié)合蛋白R(shí)OM具有同源性，在維持通路完整性中的作用至關(guān)重要［14］。FANCF基因正常表達(dá)使FA-BRCA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能夠發(fā)揮完整功能，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用;然而，F(xiàn)ANCF功能的破壞能夠明確引起卵巢癌、口腔癌、肺癌和宮頸癌等實(shí)體腫瘤發(fā)生［17～19］。推測(cè)其機(jī)制可能因?yàn)镕ANCF是一種損傷修復(fù)蛋白，F(xiàn)ANCF低表達(dá)或功能缺失，致使FANCD2蛋白不能泛素化; FA通路被破壞，使FA通路的修復(fù)、細(xì)胞周期與凋亡調(diào)控、生命信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能受損，細(xì)胞失去保護(hù)機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞染色體不穩(wěn)定，抵御外來損害的能力下降，而最終發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。本研究中，AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCF陽性表達(dá)率顯著低于對(duì)照組。提示FANCF表達(dá)下降在AML的發(fā)生過程中可能具有一定作用，與婁曄等［15，16］的研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，CR患者單個(gè)核細(xì)胞FANCF陽性表達(dá)率均高于初診和復(fù)發(fā)患者(P均＜0.01)，但是初診和復(fù)發(fā)患者比較、CR患者和對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＞0.05)。說明FANCF蛋白隨著化療療效的不同，其表達(dá)水平也存在顯著性差異。在AML的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸過程中，F(xiàn)ANCF表達(dá)先降低再恢復(fù)，這一變化規(guī)律有可能成為輔助判斷療效及方案調(diào)整的指標(biāo)之一。這可能是由于CR患者FANCF表達(dá)恢復(fù)，使下游的FANCD2單泛素化，F(xiàn)A通路修復(fù)功能恢復(fù)，細(xì)胞恢復(fù)抵御外來損害的能力而發(fā)揮正常功能。

總之，AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCF陽性表達(dá)率降低，而其中CR患者單個(gè)核細(xì)胞FANCF陽性表達(dá)率均高于初診和復(fù)發(fā)患者。說明FANCF表達(dá)降低與AML的發(fā)病有關(guān)，F(xiàn)ANCF檢測(cè)有助于AML的療效評(píng)價(jià)。但是，F(xiàn)ANCF在AML發(fā)生、發(fā)展以及化療敏感性中的作用機(jī)制尚不清楚，將來需要更大樣本、更深入的研究來驗(yàn)證。

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(收稿日期:2015-01-31)

通信作者:樊華，E-mail: fanhua66cn@163.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30670887)。

文章編號(hào):1002-266X(2015) 20-0034-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號(hào):R733.7

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.011