劉利平,江建新,鮑世韻,張育森,何婉(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,深圳市人民醫(yī)院,廣東深圳5800;湖北省腫瘤醫(yī)院)
肝癌組織中HuR和HIF-1α的表達及其相關(guān)性
劉利平1,江建新2,鮑世韻1,張育森1,何婉1
(1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,深圳市人民醫(yī)院,廣東深圳518020;2湖北省腫瘤醫(yī)院)
摘要:目的觀察人抗原R(HuR)和缺氧誘導(dǎo)因子(HIF) -1α在肝癌組織中的表達變化,并探討其相關(guān)性。方法取48例肝癌組織及癌旁組織標(biāo)本,采用免疫組化染色法檢測肝癌組織及癌旁組織中HuR和HIF-1α蛋白的表達,采用熒光定量PCR法檢測肝癌組織中HIF-1α mRNA的表達。結(jié)果肝癌組織中HuR和HIF-1α蛋白陽性表達率分別為67%和58%,顯著高于癌旁組織的19%和10% (P均<0.01)。肝癌組織中HuR與HIF-1α蛋白的表達呈正相關(guān)(r=0.723,P<0.01)。HuR蛋白高表達者中HIF-1α mRNA的表達較HuR蛋白低表達者顯著上調(diào)(P <0.05)。結(jié)論肝癌組織中HuR和HIF-1α蛋白表達上調(diào)且呈正相關(guān)關(guān)系,HuR可能增強HIF-1α mRNA的穩(wěn)定性,從而促進其表達。
關(guān)鍵詞:肝癌;人抗原R;缺氧誘導(dǎo)因子-1α; RNA結(jié)合蛋白
實體瘤在生長過程中,由于腫瘤細胞增殖過快和新生血管功能缺陷,常常造成局部組織微環(huán)境缺氧。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF) -1α是介導(dǎo)腫瘤適應(yīng)缺氧狀態(tài)的重要轉(zhuǎn)錄因子[1],在缺氧狀態(tài)下可轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi),與HIF-1β結(jié)合成為有活性的HIF-1復(fù)合物,再與下游靶基因的缺氧反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合,啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,促進腫瘤細胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥[1,2]。然而缺氧狀態(tài)下細胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄常常受到抑制,蛋白翻譯也通常受阻。人抗原R(HuR)為RNA結(jié)合蛋白,可通過與靶基因末端富含腺嘌呤和尿嘧啶的序列結(jié)合,增強mRNA的穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)蛋白翻譯[2,3]。因此,HIF-1α和HuR分別在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)腫瘤細胞對缺氧的適應(yīng)性。本研究對肝癌組織中HIF-1α和HuR蛋白表達情況進行檢測,分析二者的相關(guān)性?,F(xiàn)報告如下。
1.1臨床資料選擇深圳市人民醫(yī)院2013~2014年行手術(shù)切除的肝癌患者48例,男46例、女2例,年齡31~65歲、平均49.5歲。其中乙肝表面抗原陽性35例?;颊咝g(shù)前均未接受化療、放療及免疫治療。取手術(shù)切除的肝癌組織及對應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm以上)各48例份,液氮中保存?zhèn)溆?。?biāo)本經(jīng)10%甲醛固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋。所有標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實。
1.2檢測指標(biāo)
1.2.1HuR和HIF-1α蛋白檢測采用免疫組化法。將石蠟切片脫蠟至水,3% H2O2室溫孵育15 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶,微波抗原修復(fù),滴加10%山羊血清37℃封閉1 h。棄封閉液,加入100 μL鼠抗人HuR單克隆抗體(1∶200稀釋),4℃過夜。依次滴加生物素化二抗、親和素(試劑A)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的親和素(試劑B),PBS沖洗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察染色結(jié)果,以PBS代替一抗做為陰性對照。HuR陽性表達為細胞核染棕黃色,HIF-1α陽性表達為細胞核和(或)細胞質(zhì)染棕色。結(jié)果判定采用半定量計分法,根據(jù)陽性細胞染色強度和陽性細胞率乘積來判定。染色強度評分標(biāo)準:無特異染色為0分,輕度染色為1分,中度染色為2分,強染色為3分;陽性細胞率評分標(biāo)準:無為0分,1%~25% 為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%為4分。兩項乘積等于0~4分為低表達,5~12分為高表達。
1.2.2HIF-1α mRNA檢測采用Real-time PCR法。取約2 mm3大小的腫瘤組織,加入TRIZol液提取細胞總RNA,取1 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用Premier Primer 5軟件設(shè)計基因引物,HIF-1α引物上游5'-ACTTCTGGATGCTGGTGATTTG-3',下游5'-GCTTCGCTGTGTGTTTTGTTCT-3';β-actin引物上游5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3',下游5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'。將cDNA稀釋10倍,向每個PCR反應(yīng)孔中加入1 μL,并加入10 nmol的上、下游引物各0.5 μL,無核酸酶的超凈水8 μL和SYBR Green Supermix 10 μL。PCR反應(yīng)在ABI 7900HT熒光定量PCR檢測系統(tǒng)上運行,程序設(shè)置為: 95℃2 min; 95℃10 s,60℃60 s,循環(huán)40次; 72℃延伸10 min。擴增完畢后進行熔解曲線分析。實驗重復(fù)3次,采用2-ΔΔCt計算相對mRNA表達。
1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,計量資料用珋x±s表示,組間比較采用t檢驗,計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法,非正態(tài)分布資料采用Mann-Whitney檢驗,相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1肝癌組織和癌旁組織中HuR和HIF-1α蛋白表達HuR蛋白在肝癌中的表達主要定位于細胞核,為粗細不一的棕褐色顆粒,并有明顯的異質(zhì)性。肝癌組織和癌旁組織中的HuR蛋白陽性表達率分別為67%(32/48)和19%(9/48),二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。HIF-1α蛋白在肝癌中的表達主要定位于胞質(zhì)中,部分細胞核也有表達,呈棕黃色彌漫性分布。肝癌和癌旁組織中的HIF-1α蛋白陽性表達率分別為58% (28/48)和10% (5/48),二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
2.2肝癌組織中HuR蛋白與HIF-1α蛋白表達的相關(guān)性48例肝癌組織標(biāo)本中,HuR和HIF-1α均低表達14例,均高表達25例。同一標(biāo)本中以HIF-1α表達陽性細胞染色強度和陽性細胞率乘積評分為橫坐標(biāo),HuR表達評分為縱坐標(biāo),制成散點圖,見圖1。由圖1可見,肝癌組織中的HuR與HIF-1α表達呈正相關(guān)(r=0.723,P<0.01)。
2.3肝癌組織中HuR蛋白表達與HIF-1α mRNA的關(guān)系將肝癌組織根據(jù)HuR表達的高低分為兩組,HuR高表達組HIF-1α mRNA表達為7.96± 1.79,HuR低表達組為3.55±1.26,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
HuR蛋白是胚胎致死異常視覺基因家族中最重要的RNA結(jié)合蛋白,可通過與靶基因末端富含腺嘌呤和尿嘧啶的序列結(jié)合,增強mRNA的穩(wěn)定性并調(diào)控其蛋白翻譯。HuR在多種正常組織中都有表達,主要分布于細胞核,在炎性因子、缺氧等因素的刺激下表達增高[3,4]。HuR在膀胱癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌及結(jié)腸癌等惡性腫瘤中的表達較正常組織明顯升高,并與患者預(yù)后相關(guān)[5~7]。本研究發(fā)現(xiàn),HuR蛋白在肝癌組織中的表達較癌旁組織中顯著增高,提示HuR可能與肝癌的發(fā)生關(guān)系密切。HuR通過與其靶基因(如c-myc、P53、Cyclin D1、Cyclin A、survivin、Bcl-2、COX-2、TNF-α、VEGF、MMP-9)結(jié)合,調(diào)控癌基因、細胞周期、細胞凋亡、炎癥因子、侵襲轉(zhuǎn)移等相關(guān)分子,在腫瘤發(fā)生及惡性轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮重要作用[8,9]。
HuR蛋白的表達受多方面因素的調(diào)控。NF-κB、Smad轉(zhuǎn)錄因子可與HuR啟動子結(jié)合促進其轉(zhuǎn)錄,在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)HuR mRNA的表達。然而miR-9、miR-16、miR-34a、miR-125a和miR-519等微小RNA可與HuR的3'-末端翻譯區(qū)結(jié)合,下調(diào)HuR蛋白及mRNA的表達[9]。本研究發(fā)現(xiàn),HuR與HIF-1α蛋白在肝癌組織中的表達呈正相關(guān)關(guān)系,HIF-1α在腫瘤組織中的表達高低通常反映缺氧程度,提示缺氧可能是刺激HuR表達的重要因素。在缺氧狀態(tài)下,HIF-1α與HIF-1β結(jié)合成為有活性的HIF-1復(fù)合物,與受其調(diào)節(jié)的下游靶基因HRE結(jié)合,形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物,啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[1]。HIF-1α能否通過與HuR啟動子結(jié)合促進其基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達還有待進一步研究。
HIF-1α的表達與缺氧密切相關(guān),在缺氧狀態(tài)下泛素化蛋白水解酶受抑制,HIF-1α蛋白降解減少,從而表達增加[1]。然而在缺氧狀態(tài)下細胞整體轉(zhuǎn)錄水平下降,因此HIF-1α mRNA的表達應(yīng)該受到抑制[3]。研究表明,HuR蛋白可以增強細胞內(nèi)mRNA的穩(wěn)定性。為明確HIF-1α mRNA與HuR蛋白表達的關(guān)系,我們將肝癌組織根據(jù)HuR表達的高低分為兩組,結(jié)果顯示,HuR高表達組HIF-1α mRNA表達較低表達組明顯增高,提示HuR蛋白可能在mRNA水平調(diào)節(jié)HIF-1α的表達。研究證實,HIF-1α mRNA 的3'-和5'-末端翻譯區(qū)攜帶有多個ARE[8]。因此,雖然缺氧導(dǎo)致HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄受到抑制,但是HuR可能增加HIF-1α mRNA的穩(wěn)定性,從而上調(diào)HIF-1α蛋白的表達。同時,在CoCl2模擬缺氧條件下,HuR還可以促進HIF-1α蛋白翻譯[8]。因此,HuR蛋白在肝癌組織中可以通過多種機制上調(diào)HIF-1α的表達。
綜上所述,HuR和HIF-1α蛋白在肝癌組織中表達明顯上調(diào),且兩者表達呈正相關(guān)關(guān)系。HuR可能通過穩(wěn)定HIF-1α mRNA和促進其翻譯,從而上調(diào)HIF-1α的表達。
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Expression and correlation of HuR and HIF-1α in hepatocellular carcinoma
LIU Li-ping1,JIANG Jian-xin,BAO Shi-yun,ZHANG Yu-sen,HE Wan
(1 The Second Clinical Medical College of Jinan University,Shenzhen People's Hospital,Shenzhen 518020,China)
Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and correlation of human antigen R (HuR) and hypoxia-inducible factor (HIF) -1α in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues.Methods Forty-eight cases of HCC tissue and adjacent tissue samples were collected from patients undergoing surgical resection.The expression of HuR and HIF-1α protein in the HCC and adjacent tissues was detected by immunohistochemical staining.The mRNA expression of HIF-1α in the HCC tissues was detected by fluorescent quantitative PCR.Results The positive expression rates of HuR and HIF-1α protein in the HCC tissues were 67% and 58%,respectively.These rates were significantly higher than the positive expression rates of HuR and HIF-1α protein (19% and 10 %) in the adjacent tissues (all P<0.01).The expression of HuR protein was positively correlated with the expression of HIF-1α protein in the HCC tissues (r=0.723,P<0.01).The mRNA expression of HIF-1α mRNA in the group with high expression of HuR protein was significantly up-regulated as compared with that of the group with low expression of HuR protein (P<0.05).Conclusions The expression of HuR and HIF-1α protein was up-regulated and positively correlated with each other in the HCC tissues.HuR may enhance the stability of HIF-1α mRNA,and thus increase the expression of HIF-1α protein.
Key words:liver carcinoma; human antigen R; hypoxia-inducible factor-1α;RNA-binding protein
(收稿日期:2015-02-03)
通信作者簡介:何婉(1978-),女,主治醫(yī)師,研究方向為腫瘤基礎(chǔ)與臨床。E-mail: hewanshenzhen@ hotmail.com
作者簡介:第一劉利平(1982-),男,主治醫(yī)師,研究方向為肝癌基礎(chǔ)與臨床。E-mail: leoliping@ aliyun.com
基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(81402041、81160311)。
文章編號:1002-266X(2015) 18-0007-03
文獻標(biāo)志碼:A
中圖分類號:R735.7
doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.003