李 芳，杜麗東，妥海燕，藺興遙，李金田，吳國泰

(甘肅中醫(yī)學(xué)院敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室<培育基地>，甘肅 蘭州 730000)

·實(shí)驗(yàn)研究·

敦煌療風(fēng)虛瘦弱方對小鼠急性缺氧的保護(hù)及抗休克作用

李 芳，杜麗東，妥海燕，藺興遙，李金田，吳國泰

(甘肅中醫(yī)學(xué)院敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室<培育基地>，甘肅 蘭州 730000)

目的：觀察敦煌療風(fēng)虛瘦弱方(以下簡稱LXT)對小鼠急性缺氧的保護(hù)及抗休克作用。方法:觀察小鼠常壓缺氧條件下的存活時間；用異丙腎上腺素致小鼠急性心肌缺氧，觀察其平均存活時間；用脂多糖(LPS)致小鼠感染性休克，觀察其存活時間并計算造模后24h、48h、72h的死亡率；分別用靜脈快速推注飽和氯化鎂溶液和斷頭方法觀察LXT對小鼠急性腦缺血缺氧的影響。結(jié)果:與空白對照組對比，LXT高劑量(120g生藥/kg體質(zhì)量)、中劑量(60g生藥/kg體質(zhì)量)能明顯延長小鼠常壓缺氧存活時間(P<0.05，P<0.01)。與模型對照組對比，LXT高、中劑量均能延長異丙腎上腺素致急性心肌缺氧模型小鼠的平均存活時間(P<0.05，P<0.01)。LXT高劑量對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠休克在24h內(nèi)有一定的保護(hù)作用(P<0.05)。LXT高、中劑量能延長飽和氯化鎂致急性腦缺血小鼠的存活時間(P<0.05)；LXT高劑量能延長急性斷頭小鼠的存活時間，增加張口次數(shù)(P<0.05)。結(jié)論:LXT對小鼠急性缺氧有一定的保護(hù)作用，對內(nèi)毒素誘導(dǎo)休克小鼠具有一定的保護(hù)作用。

敦煌療風(fēng)虛瘦弱方/藥物作用；缺血缺氧/藥效學(xué)；內(nèi)毒素休克/藥效學(xué)；存活時間；動物模型；小鼠

敦煌療風(fēng)虛瘦弱方(以下簡稱LXT)是由《金匱要略》中當(dāng)歸生姜羊肉湯、黃芪桂枝五物湯、黃芪建中湯化裁而成,與《備急千金要方》所載內(nèi)補(bǔ)當(dāng)歸建中湯、羊肉湯的主治及組成有相似之處，有益氣調(diào)血、散寒化瘀、化濕通絡(luò)的功效[1]。該方具備對抗缺氧和提高機(jī)體抗應(yīng)激刺激的理論基礎(chǔ)[2-4]，但是有關(guān)其抗缺氧及抗休克方面的研究未見報道。本研究觀察LXT對小鼠急性缺氧的保護(hù)及抗休克作用，以期為LXT的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 動 物

昆明種小鼠320只，體質(zhì)量18～22g，雌雄兼用，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SCXK(甘)2011-0004。喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料(由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，飼養(yǎng)溫度(20±2)℃，相對濕度30%～50%，適應(yīng)3d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品、試劑與儀器

敦煌療風(fēng)虛瘦弱方(LXT)受試物，自制，藥物組成：當(dāng)歸、生姜各60g，黃芪、芍藥、川芎各45g，桂心、甘草各30g，羌活15g，干棗30枚(擘破)，羊精肉1 500g。以水3 500mL，先煮肉1h；去肉取汁2 500mL，下諸藥，加水1 000mL，復(fù)煎1h；取汁2 500mL，濃縮得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為172g/L的混懸液。復(fù)方丹參片，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠產(chǎn)品，批號11021185；鹽酸異丙腎上腺素注射液，上海樂豐制藥廠產(chǎn)品，批號31021344；鹽酸普萘洛爾片，東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司產(chǎn)品，批號21021826；地塞米松片，浙江仙琚制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號20120733；脂多糖，美國Sigma公司產(chǎn)品，批號137F05601；無水氯化鎂，天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，批號20120820；BSA224S型電子天平，德國Sartorius公司產(chǎn)品；Morris水迷宮，成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 統(tǒng)計學(xué)方法

2.2LXT對小鼠常壓耐缺氧時間的影響

參照文獻(xiàn)方法[5-6]。取小鼠50只，隨機(jī)分為空白對照組、復(fù)方丹參片組和LXT高、中、低劑量組5組，每組10只，依次灌胃生理鹽水、復(fù)方丹參片0.39g/kg體質(zhì)量(相當(dāng)于臨床70kg成人日用量的10倍)和LXT120，60，30g/kg體質(zhì)量(分別相當(dāng)于臨床70kg成人日用量的20，10，5倍)，給藥容量20μL/g，1d1次，連續(xù)3d。末次給藥60min后分別將每只小鼠置于底部預(yù)先放有50g新鮮鈉石灰的300mL廣口瓶中，加蓋密封，立即計時，觀察并記錄各小鼠的存活時間。以呼吸停止、翻正反射消失為死亡指征。

結(jié)果見表1。與空白對照組對比，LXT高、中劑量組和復(fù)方丹參片組小鼠存活時間延長，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表1 各組小鼠常壓耐缺氧時間對比

表1 各組小鼠常壓耐缺氧時間對比

組 別劑量/(g·kg-1)常壓耐缺氧時間/min空白對照組—13．88±2．16復(fù)方丹參片組0．3915．86±1．55LXT高劑量組12017．51±2．53??LXT中劑量組6016．14±1．64?LXT低劑量組3014．21±2．27

注： 與空白對照組對比，* P<0.05，** P<0.01。

2.3LXT對異丙腎上腺素致急性心肌缺氧小鼠存活時間的影響

參照文獻(xiàn)方法[7-8]。取小鼠60只，隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、鹽酸普萘洛爾組和LXT高、中、低劑量組6組，每組10只。LXT高、中、低劑量組分別灌胃LXT120，60，30g/kg體質(zhì)量(分別相當(dāng)于臨床70kg成人日用量的20，10，5倍)，鹽酸普萘洛爾組灌胃鹽酸普萘洛爾20μg/g體質(zhì)量(相當(dāng)于臨床70kg成人日用量的10倍)，空白對照組和模型對照組灌胃同體積的生理鹽水，給藥容量20μL/g，1d1次，連續(xù)3d。末次給藥30min后，除空白對照組外，其他各組小鼠均腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素15μg/g，30min后，分別將每只小鼠放入底部預(yù)先放有50g新鮮鈉石灰的300mL廣口瓶中，加蓋密封，立即計時，觀察并記錄各小鼠的存活時間。以呼吸停止、翻正反射消失為死亡指征。

結(jié)果見表2。與空白對照組對比，模型對照組小鼠存活時間縮短，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組對比，LXT高、中劑量組和鹽酸普萘洛爾組小鼠存活時間延長，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。LXT高、中劑量組存活時間與鹽酸普萘洛爾組對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 各組小鼠存活時間對比

表2 各組小鼠存活時間對比

組 別劑量/(g·kg-1)存活時間/min空白對照組—14．39±3．04模型對照組—13．53±2．25?鹽酸普萘洛爾組0．0216．95±4．85##LXT高劑量組12016．52±4．59#LXT中劑量組6016．41±3．74##LXT低劑量組3014．86±4．92

注：與空白對照組對比，* P<0.05，** P<0.01；與模型對照組對比，# P<0.05，## P<0.01。

2.4LXT對內(nèi)毒素休克小鼠的保護(hù)作用

參照文獻(xiàn)方法[9-10]。取小鼠60只，隨機(jī)分為空白對照組，模型對照組，地塞米松組和LXT高、中、低劑量組6組，每組10只。LXT高、中、低劑量組分別灌胃LXT120，60，30g/kg體質(zhì)量(分別相當(dāng)于臨床70kg成人日用量的20，10，5倍)，地塞米松組灌胃地塞米松30μg/g(相當(dāng)于臨床70kg成人日用量的10倍)，空白對照組和模型對照組灌胃同體積生理鹽水，給藥容量為20μL/g，1d1次，連續(xù)3d。末次給藥前30min，除空白對照組以外，其他各組小鼠均腹腔注射LPS60μg/g，30min后，給藥1次。立即計時，觀察并記錄每只小鼠的生存時間并計算24h、48h、72h死亡率。

結(jié)果見表3。模型對照組小鼠造模72h后的死亡率是100%，說明內(nèi)毒素誘導(dǎo)休克小鼠模型成功。在造模后24h，LXT高、中、低劑量組死亡率有不同程度地降低，其中LXT高劑量組較模型對照組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在造模后48h和72h，LXT高、中、低劑量組死亡率亦有降低，但組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組小鼠死亡率對比

表3 各組小鼠死亡率對比

組 別劑量/(g·kg-1)死亡率/%24h48h72h空白對照組—000模型對照組—100100100地塞米松組組0．03000LXT高劑量組12060#7070LXT中劑量組60708080LXT低劑量組3070100100

注：與模型對照組對比，#P<0.05。

2.5LXT對小鼠腦缺血、缺氧的影響[11-13]

2.5.1LXT對飽和氯化鎂致小鼠急性腦缺血的影響

取小鼠50只，隨機(jī)分為空白對照組，復(fù)方丹參片組和LXT高、中、低劑量組5組，每組10只。LXT高、中、低劑量組分別灌胃LXT120，60，30g/kg體質(zhì)量(分別相當(dāng)于臨床70kg成人日用量的20，10，5倍)，復(fù)方丹參片組灌胃復(fù)方丹參片0.39g/kg體質(zhì)量(相當(dāng)于臨床70kg成人日用量的10倍)，空白對照組灌胃同體積生理鹽水，給藥容量為20μL/g，1d1次，連續(xù)3d。各組小鼠末次給藥30min后，于尾靜脈快速推注飽和氯化鎂溶液(350g/L)造成急性腦缺血模型。記錄從尾靜脈注射開始小鼠反射性張口喘氣至最后一次的張口時間。

結(jié)果見表4。與空白對照組對比，LXT高、中劑量組和復(fù)方丹參片組小鼠存活時間延長，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組小鼠存活時間對比

表4 各組小鼠存活時間對比

組 別劑量/(g·kg-1)存活時間/s空白對照組—24．12±1．88復(fù)方丹參片組0．3927．41±3．71?LXT高劑量組12026．88±3．31?LXT中劑量組6026．21±1．93?LXT低劑量組3026．25±4．25

注：與空白對照組對比，* P<0.05.

2.5.2LXT對小鼠急性斷頭張口的影響

分組及給藥方法同2.5.1。各小鼠末次給藥30min后，用鋒利剪刀沿小鼠耳后將其頭部迅速剪下，立即計時，觀察斷頭后各小鼠張口次數(shù)及斷頭后至最后一次張口的時間。

結(jié)果見表5。與空白對照組對比，LXT高劑量組和復(fù)方丹參片組小鼠存活時間延長，張口次數(shù)增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表5 各組小鼠斷頭存活時間和張口次數(shù)對比

表5 各組小鼠斷頭存活時間和張口次數(shù)對比

組 別劑量/(g·kg-1)存活時間/s張口次數(shù)/次空白對照組—16．59±3．2811．37±4．73復(fù)方丹參片組0．3919．93±2．93?14．67±2．50?LXT高劑量組12019．32±1．66?14．15±2．52?LXT中劑量組6019．98±3．7014．00±2．14LXT低劑量組3017．14±5．3513．87±2．28

注：與空白對照組比較，* P<0.05。

3 討 論

缺氧是由于各種原因使機(jī)體組織得不到充足的氧或不能充分利用氧,引起機(jī)體代謝、機(jī)能甚至形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化,是臨床各科多種疾病和死亡的重要、常見的直接因素或主要病理過程之一。中藥和中藥復(fù)方具有多組分、多途徑、多靶點(diǎn)、有時序性的整合調(diào)節(jié)作用，在抗缺氧方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。敦煌療風(fēng)虛瘦弱方具有益氣養(yǎng)血、解表散寒之功效。方中桂心、羌活解表散寒，溫通陽氣；生姜、大棗升騰脾胃升發(fā)之氣，使氣血化源充足；當(dāng)歸、川芎、芍藥養(yǎng)血調(diào)血；黃芪、甘草益氣調(diào)中；精羊肉大補(bǔ)精血虛寒。諸藥合用，則諸癥自愈。

建立缺氧動物模型并觀察藥物對模型動物的作用是尋找和發(fā)現(xiàn)抗缺氧藥物、探索有效治療手段的重要途徑。常壓缺氧模型是將小鼠放入裝有鈉石灰的廣口瓶內(nèi)，用凡士林密閉瓶蓋；由于小鼠呼吸消耗O2，而呼出的CO2又被鈉石灰吸收，密閉容器內(nèi)氣體不斷減少，氧分壓不斷下降，造成小鼠缺氧。此方法屬于物理缺氧模型，操作簡單易行，被廣泛使用。異丙腎上腺素腹腔注射可以增加心肌耗氧量，加速小鼠耗氧速度，縮短存活時間，降低氧利用能力。此為化學(xué)藥物缺氧模型。斷頭缺氧模型是采用斷頭法中斷腦供血、供氧來制備急性完全腦缺氧模型。斷頭后在短時間內(nèi)腦中原有的血液和營養(yǎng)物質(zhì)可使腦功能維持短暫時間，小鼠顯示出有規(guī)律的張口喘氣。尾靜脈注射飽和氯化鎂可使小鼠心臟發(fā)生竇性心動過緩、傳導(dǎo)阻滯，還可抑制呼吸中樞，使呼吸肌麻痹引起死亡，腦供血停止，從而造成急性腦缺氧模型。本研究建立了上述物理、化學(xué)和機(jī)體損傷缺氧模型，觀察并記錄LXT不同劑量對缺氧動物的存活時間的影響，從多角度研究證實(shí)LXT的抗缺氧作用。研究結(jié)果顯示：LXT高、中劑量能明顯延長小鼠常壓缺氧和化學(xué)藥物異丙腎上腺素引起缺氧模型小鼠的平均存活時間；LXT對急性腦缺血缺氧有一定的保護(hù)作用，LXT高、中劑量能顯著延長飽和氯化鎂致小鼠急性腦缺血小鼠的存活時間，LXT高劑量能延長急性斷頭小鼠的存活時間，增加張口次數(shù)。

脂多糖是內(nèi)毒素的主要化學(xué)成分，可激活單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，釋放TNF-α等許多細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞、組織、器官損傷，從而引起實(shí)驗(yàn)動物休克。本實(shí)驗(yàn)中，LXT高、中、低劑量組的死亡率有不同程度地降低，但是與模型對照組對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。

LXT對小鼠急性缺氧的保護(hù)作用和降低脂多糖所致休克小鼠死亡率的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)04-0061-04

R

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.04.32

吳國泰，講師，wgt@gszy.edu.cn

敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(DHYX1212-010)

2014-11-10；

2015-02-02