秦明春,賀 蘭,張 吉,林 忠,李 利

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院婦科，廣西 南寧 531000)

·實(shí)驗(yàn)研究·

菟絲子含藥血清對(duì)TNF-α誘導(dǎo)下人蛻膜細(xì)胞凋亡的影響*

秦明春,賀 蘭,張 吉,林 忠,李 利

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院婦科，廣西 南寧 531000)

目的：通過(guò)菟絲子含藥血清對(duì)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)人體外培養(yǎng)蛻膜細(xì)胞凋亡的影響，以期從蛻膜細(xì)胞凋亡角度探討菟絲子可能的安胎機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)人蛻膜細(xì)胞，通過(guò)TNF-α誘導(dǎo)蛻膜細(xì)胞凋亡，菟絲子含藥血清干預(yù)，MTT比色實(shí)驗(yàn)分析TNF-α及菟絲子含藥血清作用后人蛻膜細(xì)胞活力，并用流式細(xì)胞術(shù)分析菟絲子含藥血清對(duì)人蛻膜細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：TNF-α作用后的人蛻膜細(xì)胞活性均低于空白對(duì)照組，隨著TNF-α質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，活性越來(lái)越??；10，50μg/L的TNF-α作用后，與空白對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。200mL/L菟絲子含藥血清干預(yù)后的人蛻膜細(xì)胞活性高于TNF-α凋亡模型組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)示菟絲子含藥血清作用后的人蛻膜細(xì)胞凋亡率低于凋亡模型組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：TNF-α能降低體外培養(yǎng)人蛻膜細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；菟絲子含藥血清對(duì)TNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)的人蛻膜細(xì)胞凋亡有一定抑制作用。

菟絲子；流式細(xì)胞術(shù)；細(xì)胞凋亡；人蛻膜細(xì)胞；安胎/藥效學(xué)

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)有序性的死亡。在妊娠過(guò)程中，早孕期人體蛻膜細(xì)胞的退化就是以凋亡的形式發(fā)生。隨著妊娠的進(jìn)展，蛻膜細(xì)胞的凋亡會(huì)明顯減少，并與滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入達(dá)到一種相對(duì)的穩(wěn)定狀態(tài)。在病理狀態(tài)下,如感染引起的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)增多等，這種穩(wěn)態(tài)被打破，就可能會(huì)使凋亡細(xì)胞增加，影響胚胎發(fā)育，導(dǎo)致胚胎流產(chǎn)。菟絲子作為傳統(tǒng)的“補(bǔ)腎安胎”圣藥，其安胎作用已被長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐所證明。本研究采用TNF-α誘導(dǎo)人體外蛻膜細(xì)胞凋亡，通過(guò)菟絲子含藥血清干預(yù)，觀察菟絲子含藥血清對(duì)蛻膜細(xì)胞異常凋亡的影響，以期從早孕蛻膜細(xì)胞凋亡角度研究探討菟絲子保胎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

取自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院婦科早孕人流手術(shù)室早孕40d左右健康孕婦人流蛻膜組織，并取得患者的知情同意。

1.2 藥品、試劑與儀器

菟絲子含藥血清，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥物制劑實(shí)驗(yàn)室制備，-20 ℃ 下無(wú)菌保存。DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司產(chǎn)品，批號(hào)AQK29046)、類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(Hyclone公司產(chǎn)品，批號(hào)20130105)、胰蛋白酶(Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)ZJ0451)，均購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；膠原酶Ⅱ，Gibco公司產(chǎn)品，批號(hào)20100-17，購(gòu)自上海艾研生物科技有限公司；TNF-α，Bioche產(chǎn)品，進(jìn)口分裝，批號(hào)M092904B，購(gòu)自上海貝西科技發(fā)展有限公司；兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒，批號(hào)50766924，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。TECANSUNRISE型酶標(biāo)分析儀，產(chǎn)地奧地利；流式細(xì)胞儀，美國(guó)Becton-Dickinson公司產(chǎn)品。

1.3 人體外蛻膜細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)[1]加以改進(jìn)，采用全組份蛻膜細(xì)胞的培養(yǎng)方式。無(wú)菌條件下取健康早孕40d左右人工流產(chǎn)蛻膜組織送至實(shí)驗(yàn)室；用冰D-hank’s液反復(fù)洗涮干凈；于無(wú)菌玻璃皿中剪碎成糊狀；用2倍體積的復(fù)合消化酶(2.5g/L胰蛋白酶，2g/L透明質(zhì)酸酶和2g/L膠原酶按2∶1∶2比例混合而成)充分混勻后置于37 ℃，50mL/LCO2的培養(yǎng)箱中靜置30min；用含200mL/L無(wú)菌胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化；收集消化后的上清液于無(wú)菌離心管中，1 000r/min離心 5min，收集細(xì)胞沉淀；同法再消化2次混合；用培養(yǎng)液重懸后計(jì)數(shù)細(xì)胞，以約5.0×105個(gè)/mL的量接種培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、50mL/LCO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24h后換液，清除紅細(xì)胞和未貼壁細(xì)胞；隔日換液，長(zhǎng)滿后傳代。將培養(yǎng)3代細(xì)胞在載玻片上爬片，采用鏈霉素—生物素—過(guò)氧化物酶法(SABC)法進(jìn)行細(xì)胞爬片的PRL免疫組化染色，操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 菟絲子含藥血清的制備

將20只Wistar大鼠隨機(jī)分為菟絲子組和空白組2組。制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為170g/L的菟絲子藥液，給藥劑量=臨床常用量×動(dòng)物等效面積系數(shù)×5，每100g體質(zhì)量Wistar大鼠灌胃 2mL藥液，空白組給予等量生理鹽水灌胃，每日給藥2次，連續(xù)1周。于最后一次給藥1h后，無(wú)菌操作下采腹主動(dòng)脈血；于4 ℃靜置2h，用低溫離心機(jī) 3 500r/min離心15min；收集血清；56 ℃恒溫滅活 30min；用 0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌；-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)TNF-α對(duì)蛻膜細(xì)胞活力的影響

采用MTT比色實(shí)驗(yàn)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)按1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)使其貼壁。TNF-α設(shè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5，2.0，10.0，50.0μg/L4組，每組3孔，并設(shè)空白對(duì)照組。培養(yǎng)24h，加入MTT溶液(5g/L)孵育4h，終止培養(yǎng)，吸走培養(yǎng)液，每孔加入150μL的DMSO, 置于搖床上低速振蕩約10min，待結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀于490nm處測(cè)量吸光值。細(xì)胞活力(%)=處理組OD值/空白對(duì)照OD值×100%。

1.5.2 200mL/L菟絲子含藥血清對(duì)TNF-α誘導(dǎo)蛻膜細(xì)胞的細(xì)胞活力影響

采用MTT比色實(shí)驗(yàn)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)按1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)使其貼壁。以1.5.1項(xiàng)下確定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10μg/L的TNF-α造模，含藥血清以預(yù)試驗(yàn)確定的 200mL/L菟絲子含藥血清加入。設(shè)TNF-α凋亡模型組、TNF-α+200mL/L菟絲子含藥血清組和空白對(duì)照組，每組3孔。培養(yǎng) 24h后同前加入MTT用酶標(biāo)儀于490nm處測(cè)量各孔的吸光值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.5.3TNF-α+200mL/L菟絲子含藥血清對(duì)蛻膜細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)以2×105～5×105個(gè)/mL細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)使其貼壁。設(shè)TNF-α凋亡模型組、TNF-α+200mL/L菟絲子含藥血清組和空白對(duì)照組共3組，每組2瓶。培養(yǎng) 24h后收集細(xì)胞，按1×106/mL調(diào)整細(xì)胞濃度于4 ℃預(yù)冷的700mL/L乙醇固定18h以上，取細(xì)胞懸液，用PBS洗3次，重懸于1mLPI染液中，37 ℃孵育30min進(jìn)行流式分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 人蛻膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

蛻膜細(xì)胞消化、接種后30min即開(kāi)始貼壁，逐漸生長(zhǎng)呈較長(zhǎng)的梭形狀和不規(guī)則星形；培養(yǎng)3～4d即可鋪滿瓶底，HE染色示：細(xì)胞核呈卵圓形，位于細(xì)胞中央，核仁清晰，有豐富的胞漿顆粒。PRL免疫組化染色鑒定見(jiàn)胞漿內(nèi)細(xì)小棕色顆粒，越近細(xì)胞核，染色越強(qiáng)，計(jì)數(shù)結(jié)果顯示 95%以上細(xì)胞PRL染色陽(yáng)性，且細(xì)胞大小、形態(tài)均一。

2.2TNF-α對(duì)蛻膜細(xì)胞的細(xì)胞活力影響

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5，2.0，10.0，50.0μg/LTNF-α作用后的蛻膜細(xì)胞活力均低于空白對(duì)照組，并且隨著TNF-α質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，細(xì)胞活力變小。10μg/L和50μg/L組細(xì)胞活力與空白對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，50μg/L時(shí)細(xì)胞大量死亡。見(jiàn)表1。

表1 各組蛻膜細(xì)胞的細(xì)胞活力檢測(cè)

表1 各組蛻膜細(xì)胞的細(xì)胞活力檢測(cè)

組 別細(xì)胞活力/%空白對(duì)照組80．45±12．320．5μg/LTNF?α組65．37±9．402．0μg/LTNF?α組50．45±7．3310．0μg/LTNF?α組38．34±5．54?50．0μg/LTNF?α組11．08±3．21?

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，* P<0.05。

2.3 200mL/L菟絲子含藥血清對(duì)TNF-α誘導(dǎo)蛻膜細(xì)胞的細(xì)胞活力影響

200mL/L菟絲子含藥血清作用后的蛻膜細(xì)胞活力明顯高于TNF-α凋亡模型組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但較空白對(duì)照組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組蛻膜細(xì)胞的細(xì)胞活力檢測(cè)

表2 各組蛻膜細(xì)胞的細(xì)胞活力檢測(cè)

組 別細(xì)胞活力/%空白對(duì)照組80．45±12．32TNF?α凋亡模型組38．34±5．54?TNF?α+200mL/L菟絲子含藥血清組68．22±8．54#

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，* P<0.05；與TNF-α凋亡模型組對(duì)比，# P<0.05。

2.4TNF-α+200mL/L菟絲子含藥血清對(duì)蛻膜細(xì)胞凋亡的影響

菟絲子含藥血清作用后的蛻膜細(xì)胞凋亡率明顯低于TNF-α凋亡模型組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3及圖1。

表3 各組蛻膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

表3 各組蛻膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

組 別凋亡率/%空白對(duì)照組2．87±0．51TNF?α凋亡模型組11．72±2．05?TNF?α+200mL/L菟絲子含藥血清組4．03±0．80?#

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，* P<0.05；與TNF-α凋亡模型組對(duì)比，# P<0.05。

圖1 各組蛻膜細(xì)胞凋亡流式散點(diǎn)圖

3 討 論

蛻膜是胚泡植入后子宮內(nèi)膜間質(zhì)高度分化而轉(zhuǎn)化的結(jié)果，在雌、孕激素和溶解產(chǎn)物等的調(diào)控下生長(zhǎng)分化構(gòu)成胎盤的母面組織，與子面而來(lái)的滋養(yǎng)層共同構(gòu)成了母胎界面[2]，對(duì)妊娠的繼續(xù)和維持起到重要作用。有研究[3]表明：人早孕期蛻膜需要一定程度的退化，為滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入提供空間。這種退化就是以凋亡的形式發(fā)生的，但蛻膜細(xì)胞的凋亡有一定的時(shí)空限制，若凋亡細(xì)胞增加或發(fā)生異常凋亡，就可能會(huì)影響妊娠的繼續(xù)。人正常早孕約40d時(shí)，蛻膜細(xì)胞的凋亡與滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入同步發(fā)生；早孕50d時(shí)，蛻膜組織的凋亡、重建和滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)[4]。若這一穩(wěn)態(tài)打破，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，胎盤發(fā)育受阻，妊娠終止。CinarO等[5]研究發(fā)現(xiàn)：復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜細(xì)胞凋亡與正常妊娠蛻膜相比顯著增加。李雪蓮[6]等研究發(fā)現(xiàn)：早孕自然流產(chǎn)蛻膜中TNF-α的表達(dá)明顯高于正常早妊組。早孕孕婦蛻膜組織中的TNF-α主要由激活的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，體內(nèi)適量的TNF-α對(duì)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育可能是必需的，而病理狀態(tài)下異常大量產(chǎn)生的TNF-α則會(huì)促使蛻膜細(xì)胞的過(guò)度凋亡及死亡，影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入及胎盤的形成，影響胚胎發(fā)育。菟絲子為經(jīng)典“補(bǔ)腎安胎”圣藥之一，臨床廣泛使用，其安胎功效已被長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐所證實(shí)。藥理研究表明：菟絲子黃酮為菟絲子的主要成分，具有雌激素樣活性及抗氧化、清除自由基等多種生物活性[7]。有研究[8]顯示：菟絲子黃酮可以增加雌激素受體和促黃體激素受體的表達(dá)。在本研究中，MTT比色實(shí)驗(yàn)提示TNF-α作用后的人體外培養(yǎng)蛻膜細(xì)胞活力明顯降低，TNF-α量越大，活力越小；流式細(xì)胞術(shù)提示10μg/LTNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)的蛻膜細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此表明：TNF-α能明顯抑制細(xì)胞增殖分裂的過(guò)程，降低細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。菟絲子含藥血清干預(yù)TNF-α誘導(dǎo)蛻膜細(xì)胞后其凋亡率小于TNF-α組(P<0.05)，說(shuō)明菟絲子含藥血清對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的蛻膜細(xì)胞凋亡有抑制作用。本研究初步表明：菟絲子在一定程度上能抑制早孕40d左右蛻膜細(xì)胞的異常凋亡。

妊娠是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，蛻膜細(xì)胞的退化凋亡和滋養(yǎng)細(xì)胞侵入之間的平衡只是一個(gè)方面，并且這種平衡還受到諸多調(diào)控因子的調(diào)節(jié)。菟絲子補(bǔ)腎安胎作用除了抑制蛻膜細(xì)胞的異常凋亡外，有否從細(xì)胞因子的調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)等其他方面來(lái)調(diào)節(jié)妊娠過(guò)程中的平衡狀態(tài)從而達(dá)到保胎的作用，尚需進(jìn)一步研究。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)04-0065-03

R

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.04.33

廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金(2012jjBA40062)

2014-11-19；

2015-03-04