米 智 徐 水 朱 勇

(1.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716；2.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009)

添食氟化物后家蠶中腸和血液中氟離子的吸收累積規(guī)律*

米 智1,2徐 水1朱 勇1

(1.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716；2.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009)

為了探討氟離子在家蠶中腸和血液中的吸收累積情況，以家蠶耐氟品種T6和氟化物敏感品種734為研究材料，從5齡起蠶開始分別添食經(jīng)50、100、200、400mg/kg NaF溶液浸泡后的新鮮桑葉，檢測(cè)家蠶血液和中腸中氟離子濃度的變化規(guī)律。結(jié)果表明，不論是敏感品種734還是耐氟品種T6，均表現(xiàn)為隨添氟濃度增大氟離子濃度呈增大的趨勢(shì)，在中腸中，734添氟組氟離子濃度分別是對(duì)照組的1.29，1.39，1.63，2.41倍，T6分別為1.30，1.43，1.75，2.41倍；在血液中，734添氟組氟離子濃度分別是對(duì)照組的1.17，1.34，1.69，1.97倍，T6分別為1.17，1.21，1.28，1.43倍。推測(cè)耐氟品種家蠶T6中腸代謝或排泄氟離子的能力強(qiáng)于敏感品種家蠶734。

家蠶；血液；中腸；氟離子；吸收累積

近年來隨著工業(yè)的發(fā)展,陶瓷、磚瓦、磷肥、煉鋁、水泥、玻璃、火力發(fā)電等部門排放的廢氣中含有大量氟化物，給蠶桑生產(chǎn)帶來較大的危害。氟化物是一類原生質(zhì)毒劑，易透過各種組織的細(xì)胞壁與原生質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生毒性效應(yīng)[1-2]。研究表明，氟化物隨桑葉進(jìn)入蠶體累積于消化液、腸壁和體壁等處，通過消化管進(jìn)入血液，在血液和組織中與蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制生長(zhǎng)發(fā)育，出現(xiàn)氟中毒癥狀[3]。

氟離子測(cè)定方法常用的有氟離子選擇電極法、高溫灰化—堿融法、濕灰化—?dú)怏w吸收法等[4-5]。其中氟離子電極法，具有簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，完全可以應(yīng)用于多樣品實(shí)驗(yàn)中的氟離子含量測(cè)定。其余方法程序復(fù)雜，測(cè)定成本高，所需時(shí)間長(zhǎng)。對(duì)于蠶桑業(yè)中氟化物污染程度的鑒定，要求快速、便捷、準(zhǔn)確，氟離子選擇電極法更為適合。

氟離子選擇電極檢測(cè)方法采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法[6-7]：即置電極于一系列的標(biāo)準(zhǔn)液中，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液的電極電位。標(biāo)準(zhǔn)液的范圍應(yīng)包括預(yù)計(jì)樣品溶液的濃度，然后測(cè)量樣品溶液的電極電位。在對(duì)半數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對(duì)數(shù)值(橫坐標(biāo))與相應(yīng)的電極電位(縱坐標(biāo))。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程，求得樣品溶液的氟離子濃度。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定時(shí)，測(cè)定液的pH值應(yīng)在5～6左右，因?yàn)榉x子選擇電極一般以pH在5～6之間測(cè)定值較為準(zhǔn)確。

本實(shí)驗(yàn)在已知家蠶耐氟性的前提下，檢測(cè)不同組織中氟離子濃度，以期探明氟離子在不同組織中的累積情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

家蠶耐氟品種T6、敏感品種734，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供，西南大學(xué)家蠶遺傳育種室保存。按照常規(guī)方法飼養(yǎng)到5齡起蠶時(shí)，將家蠶分區(qū)飼養(yǎng)。對(duì)照組喂食清水浸泡11min后自然晾干的新鮮桑葉，試驗(yàn)組分別用50、100、200、400mg/kg NaF溶液浸泡11min后自然晾干的桑葉飼養(yǎng)[8]，每隔8h添食1次，每天添食3次。試驗(yàn)采用平行設(shè)計(jì)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。從5齡起蠶第1～7d每天分別在冰盤上取各組幼蟲的組織樣品。

1.2 樣品處理

①將蠶體體表用蒸餾水清洗干凈，并用吸水紙擦干，使蠶體彎曲，用無菌剪刀剪其腹足使血液滴于事先放置在冰上的離心管中，取0.5mL用作測(cè)試樣品；

②將蠶體置于冰盤上解剖，小心取出中腸，去掉中腸的內(nèi)容物，用0.9%生理鹽水沖洗干凈；

③取10頭家蠶中腸，加入5mL 0.04M pH7.0的PBS進(jìn)行勻漿，取1mL作為測(cè)試樣品。

④將測(cè)試樣品置于50mL容量瓶中，加10mL鹽酸，密閉浸泡提取1h(不時(shí)輕輕搖動(dòng))，應(yīng)量避免樣品粘于瓶壁上。提取后加25mL總離子強(qiáng)度緩沖劑，加水至刻度，混勻，測(cè)定。

1.3 試劑和藥品

本實(shí)驗(yàn)所用水均為超純水，試劑全部貯于聚乙烯塑料瓶中。氟化鈉(NaF)需經(jīng)95～105℃干燥4h后冷卻(至恒重)使用。濃鹽酸(HCl)，乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)，檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2H2O)，乙酸(CH3COOH)，氫氧化鈉(NaOH)，高氯酸(HClO4)，氯化鈉(NaCl)均由科隆化工有限公司。

1.4 儀器與設(shè)備

PHS-3C型精密酸度計(jì)(成都世紀(jì)方舟科技有限公司)，PF-1型氟離子選擇性電極(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，雷磁232型參比電極(上海雷磁儀器廠)，78-1型磁力加熱攪拌器(金壇市富華儀器有限公司)，純水儀(德國millipor-DQ3)。

1.5 試劑配制

①1mol/L鹽酸：取10mL濃鹽酸，超純水稀釋，定容至120mL；

②1mol/L乙酸：準(zhǔn)確量取57.23mL冰乙酸，超純水稀釋，定容至1 000mL；

③3mol/L乙酸鈉溶液：稱取204g乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)溶于300mL水中，加1mol/L乙酸，調(diào)節(jié)pH至7.0，超純水稀釋，定容至500mL；

④0.75mol/L檸檬酸鈉溶液：稱取110g檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2H2O)溶于300mL水中，加14mL高氯酸，再加水稀釋，定容至500mL；

⑤總離子強(qiáng)度緩沖劑：3mol/L乙酸鈉溶液與0.75mol/L檸檬酸鈉溶液等量混合，現(xiàn)配現(xiàn)用；

⑥氟標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.22g氟化鈉，溶于水，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存；

⑦氟標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取10.0mL氟標(biāo)準(zhǔn)溶液置于100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。如此反復(fù)稀釋此溶液至氟離子濃度為1.0μg/mL。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 繪制氟離子標(biāo)準(zhǔn)曲線

①接通酸度計(jì)電源，預(yù)熱20min；

②將酸度計(jì)按鍵選擇置“mv”位置，此時(shí)儀器顯示應(yīng)為0.00；

③取下飽和甘汞電極下端和上端小膠帽，檢查電極內(nèi)液位、晶體氣泡及多孔型物質(zhì)的滲漏情況；

④若都合格，則用蒸餾水清洗電極外部，用濾紙吸干外壁水分，若不合格，則加入飽和的KCl，以滿足電極需要；

⑤取出已在10～3mol/L的NaF溶液中浸泡活化2h以上的氟離子電極；

⑥檢查電極晶片內(nèi)側(cè)是否有氣泡。若有，應(yīng)讓電極下端晶片朝上，輕擊電極桿以趕出氣泡；

⑦將飽和甘汞電極和氟離子電極分別置于電極夾上，并接入儀器；

⑧取6個(gè)潔凈的50mL容量瓶，分別加入10μg/mL氟標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，并在各容量瓶中分別加入總離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)緩沖劑25mL和1mol/L鹽酸10mL，用蒸餾水稀釋至標(biāo)線后混勻，并依次由1到6編號(hào)；

⑨取一潔凈的50mL小燒杯，裝上40mL蒸餾水并放在電磁攪拌器托座上，插入兩電極。開啟電磁攪拌器，調(diào)節(jié)電磁攪拌器轉(zhuǎn)速；

⑩觀察儀器上的電位值，若數(shù)值接近370mv，說明氟電極已清洗好；如果相差甚遠(yuǎn)，應(yīng)重?fù)Q蒸餾水，再洗直至顯示值與370mv電位值相近；

1.6.2 樣品測(cè)定與分析

實(shí)驗(yàn)方法與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線相同。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel軟件進(jìn)行作圖，并做標(biāo)準(zhǔn)誤差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)已知氟離子濃度的檢測(cè)結(jié)果，縱坐標(biāo)為“MV”的絕對(duì)值，橫坐標(biāo)為氟離子濃度對(duì)數(shù)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程式y(tǒng)=33.53x+238，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。

圖1 氟離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同組織中氟離子濃度變化

2.2.1 中腸中氟離子濃度變化

從圖2、圖3可以看到：734對(duì)照組中腸氟離子濃度在前2d呈上升趨勢(shì)，之后呈下降。第3d和第4d的氟離子含量基本相同，第5d含量略上升，隨后下降，第6d和7d又相當(dāng)，整個(gè)試驗(yàn)期出現(xiàn)2個(gè)極大值，即第2d和第5d；50、100、200mg/kg NaF處理組的氟離子濃度變化趨勢(shì)基本同對(duì)照組一致，50mg/kg NaF處理組和100mg/kg NaF處理組在整個(gè)試驗(yàn)期氟離子濃度相似，僅在第1d含量略有差異，400mg/kg NaF處理組前3d呈上升趨勢(shì)，后4d也呈上升趨勢(shì)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期出現(xiàn)2個(gè)極小值，即第1d和第4d。從整個(gè)圖上可以看到，中腸氟離子濃度是隨著添氟濃度的增大，呈增大的變化趨勢(shì)，尤其400mg/kg NaF處理組(第1d除外)，氟離子濃度遠(yuǎn)大于其它各組。

T6對(duì)照組中腸氟離子濃度變化較平穩(wěn)，在0.05～0.09μg/mL之間波動(dòng)，前2d的濃度略高于其它時(shí)間段；50mg/kg NaF處理組的氟離子濃度在第5d有個(gè)上升的峰值，其余時(shí)間呈平緩的下降趨勢(shì)；100mg/kg NaF處理組前3d氟離子濃度相同，之后在0.1μg/mL上下波動(dòng)；200mg/kg NaF處理組的氟離子濃度在前3d呈下降趨勢(shì)，隨后先升后降，第5d含量達(dá)最大值；400mg/kg NaF處理組呈波折型變化趨勢(shì)，整個(gè)試驗(yàn)期(除第6d外)氟離子濃度遠(yuǎn)大于其他處理組。

不論734還是T6，隨著添氟濃度的增加，中腸中氟離子濃度隨之增大。734添氟組氟離子平均濃度分別約為對(duì)照組的1.29，1.39，1.63，2.41倍，T6分別越為1.30，1.43，1.75，2.41倍。

圖2 5齡家蠶734幼蟲添食NaF后中腸氟離子濃度變化

2.2.2 血液中氟離子濃度變化

從圖4、圖5可以看到：734各個(gè)處理組氟離子濃度變化趨勢(shì)較一致，前6d呈先降后升的趨勢(shì)，在第7d又下降。添氟處理第1d氟離子濃度關(guān)系為：400mg/kg NaF處理組>100mg/kg NaF處理組>200mg/kg NaF處理組>50mg/kg NaF處理組>0mg/kg NaF處理組，添氟處理第6d氟離子濃度關(guān)系為：400mg/kg NaF處理組≈100mg/kg NaF處理組>200mg/kg NaF處理組≈50mg/kg NaF處理組>0mg/kg NaF處理組，其余時(shí)間段均隨著添氟濃度的增加，血液中的氟離子濃度呈增加的趨勢(shì)。

T6各處理組(400mg/kg NaF處理組除外)血液氟離子濃度變化趨勢(shì)同734一致，但比734平緩；400mg/kg NaF處理組的氟離子濃度在前5d在0.35μg/mL上下波動(dòng)，之后同其余各處理組；添氟處理第1d氟離子濃度關(guān)系為：50mg/kg NaF處理組>100mg/kg NaF處理組>200mg/kg NaF處理組≈400mg/kg NaF處理組≈對(duì)照組，其余時(shí)間段均隨著添氟濃度的增加，血液中的氟離子濃度也呈增加趨勢(shì)。

不論734還是T6，隨著添氟濃度的增加，血液中氟離子濃度隨之增大。734添氟組氟離子平均濃度分別約為對(duì)照組的1.17，1.34，1.69，1.97倍，T6分別越為1.17，1.21，1.28，1.43倍。

圖4 5齡家蠶734幼蟲添食NaF后血液氟離子濃度變化

圖5 5齡家蠶T6幼蟲添食NaF后血液氟離子濃度變化

3 討論與結(jié)論

不同家蠶品種對(duì)氟化物的耐受性能不同，給家蠶添食經(jīng)氟化鈉溶液浸泡后的桑葉，氟離子會(huì)在家蠶體內(nèi)不同組織中累積。氟化物是一類原生質(zhì)毒劑，主要毒理作用屬于胃毒，作用對(duì)象有消化、呼吸、神經(jīng)、循環(huán)等系統(tǒng)。氟化物隨桑葉進(jìn)入蠶體被消化吸收，通過消化管進(jìn)入血液，部分從糞便中排出，而大部分累積于腸壁和體壁等處，并以離子形式作用于細(xì)胞原生質(zhì)[3]。故對(duì)家蠶而言，消化系統(tǒng)中腸則為氟攻擊的首要靶標(biāo)器官，中腸受到損傷，其鈣鎂離子，酶活性，糖類，脂肪，以及核酸物質(zhì)等生物大分子均發(fā)生了變化或者造成了不可逆的改變。家蠶體內(nèi)又是開放性系統(tǒng)，血液在傳輸物質(zhì)方面起到了不可代替的作用，氟離子也會(huì)對(duì)家蠶血淋巴造成巨大的損害。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同耐氟性家蠶品種添食NaF，檢測(cè)7d內(nèi)不同濃度NaF處理后中腸氟離子的平均濃度，隨著氟化物濃度的增加，與對(duì)照組相比，734添氟組從1.29倍增加到2.42倍，T6從1.30倍增加到2.41倍。在血液中，734的平均濃度由1.17倍增加到1.97倍，而T6從1.18倍增加到1.43倍。

從測(cè)定的數(shù)據(jù)分析，在上述2個(gè)不同組織中既表現(xiàn)出了相同點(diǎn)，也具有差異點(diǎn)。相同點(diǎn)是，不管是氟化物敏感品種734還是耐氟品種T6，不管是中腸還是血液，其氟離子濃度均隨著添氟濃度的增加呈上升趨勢(shì)。不同點(diǎn)是：通過上述數(shù)據(jù)比較可得，添氟處理后734和T6兩家蠶品種中腸中氟離子相對(duì)累積濃度基本一致；而在血液中，734隨著NaF濃度的增大，與對(duì)照組相比，添氟組的平均氟離子濃度由1.17倍增加到1.97倍，T6由1.18倍增加到1.43倍。

添氟濃度為50和100mg/kg處理后2品種的氟離子相對(duì)累積濃度差異不大，但添氟濃度為200和400mg/kg處理后的氟離子相對(duì)累積濃度，734顯著大于T6的。由上述數(shù)據(jù)可推測(cè)，在高濃度氟化物處理下，T6代謝或排泄氟離子的能力遠(yuǎn)強(qiáng)于734，因此734血液中氟離子濃度累積相對(duì)較大。

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Absorption and Accumulation of Fluoride Ion in the Hemolymph and the Midgut ofBombyxmoriAfter Feeding with Fluoride

MI Zhi1,2*XU Shui1ZHU Yong1

(1.CollegeofBiotechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China；2.CollegeofLifeScience,DatongUniversity,Datong,Shanxi037009,China)

In order to understand the absorption and accumulation of fluoride ion in the hemolymph and the midgut of silkworm (Bombyxmori), the fluoride-resistant silkworm variety T6 and the fluoride-sensitive variety 734 were used as study materials, and their larvae were fed with mulberry leaves soaked in 50, 100, 200 or 400 mg/kg NaF solutions from the first day of the fifth instar. Then the fluoride ion concentration in the hemolymph and the midgut were examined. The results showed that the fluoride ion concentration in the hemolymph and the midgut increased with increasing fluoride added in both varieties. In the midgut, the fluoride ion concentration of the NaF-treated group of 734 was 1.29, 1.39, 1.63 and 2.41 times that of the control group, and 1.30, 1.43, 1.75 and 2.41 times that of the control group, respectively. In the hemolymph, the fluoride ion concentration of the NaF-treated group of 734 was 1.17, 1.34, 1.69 and 1.97 times that of the control group, and 1.17, 1.21, 1.28 and 1.43 times that of the control group, respectively. It is speculated that the ability of T6 to metabolize or excrete fluoride in the midgut is stronger than that of 734.

Bombyxmori; hemolymph; midgut; fluoride ion; absorption and accumulation

*資助項(xiàng)目：重慶市“十百千萬”優(yōu)質(zhì)蠶繭工程公共項(xiàng)目； 山西大同大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目。

米 智(1985-)，男，山西，博士研究生，主要從事家蠶遺傳育種研究，E-mail:mizhi775@126.com通訊作者：朱 勇，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：023-68251939，E-mail: zhuy@swu.edu.cn