楊聲波　王聰　黃紹南　毛瑜坤　許子星　李貴雙　陳鵬

作者單位: 362261福建省晉江市安海醫(yī)院骨科(楊聲波、王聰、黃紹南、毛瑜坤);福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科(許子星、李貴雙、陳鵬)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎氧化應(yīng)激指標(biāo)的臨床分期檢測(cè)及分析

楊聲波王聰黃紹南毛瑜坤許子星李貴雙陳鵬

作者單位: 362261福建省晉江市安海醫(yī)院骨科(楊聲波、王聰、黃紹南、毛瑜坤);福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科(許子星、李貴雙、陳鵬)

【摘要】目的檢測(cè)不同臨床分期膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(OA)患者血清及關(guān)節(jié)液氧化應(yīng)激指標(biāo)水平，分析其臨床應(yīng)用價(jià)值。方法2011年7月至2013年6月，收集符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)OA診斷標(biāo)準(zhǔn)(ACR2007)的患者49例(觀察組)，臨床分期為Ⅰ期者10例，Ⅱ期15例，Ⅲ期13例，Ⅳ期11例。以同時(shí)期健康體檢志愿者16例(無(wú)OA病史、X線檢查排除OA診斷)作為對(duì)照(對(duì)照組)，2組均抽取空腹靜脈血和膝關(guān)節(jié)液。WST-1法測(cè)定過(guò)氧化物歧化酶(SOD)活性，化學(xué)法測(cè)總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平，統(tǒng)計(jì)并分析各指標(biāo)的波動(dòng)。結(jié)果與對(duì)照組相比，觀察組血清與關(guān)節(jié)液T-AOC，MDA均顯著增高(P＜0.01)，SOD，GSH顯著降低(P＜0.01)。與對(duì)照組相比，觀察組Ⅰ期OA患者血清及關(guān)節(jié)液T-AOC水平即顯著升高，Ⅱ期兩者均進(jìn)一步升高，Ⅲ期與Ⅳ期之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但均較Ⅱ期高。觀察組血清MDA水平顯著升高(P＜0.01)，各分期之間MDA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而關(guān)節(jié)液中，Ⅱ期OA患者較I期MDA水平顯著升高，Ⅲ、Ⅳ期MDA水平進(jìn)一步升高，而2期之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。觀察組OA患者血清SOD活力均明顯降低(P＜0.01)，4期間SOD活力水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而關(guān)節(jié)液中，Ⅰ～Ⅳ期SOD水平逐漸下降，Ⅰ期患者SOD水平較對(duì)照組即明顯下降(P＜0.01)，Ⅱ期較Ⅰ期進(jìn)一步下降，Ⅲ、Ⅳ期之間SOD水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但均較Ⅱ期低(P＜0.01)。對(duì)照組與觀察組各分期血清GSH水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而關(guān)節(jié)液中，觀察組Ⅰ期OA患者GSH水平較對(duì)照組升高(P＜0.05)，至Ⅱ期GSH水平達(dá)到頂點(diǎn)(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ期GSH水平下降，均低于對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)論不同臨床分期OA患者血清及關(guān)節(jié)液氧化應(yīng)激指標(biāo)水平不同;關(guān)節(jié)液及血清氧化應(yīng)激指標(biāo)T-AOC、MDA、SOD和GSH可作為評(píng)估OA患者病情，判斷預(yù)后的依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】膝關(guān)節(jié);骨性關(guān)節(jié)炎;氧化應(yīng)激;關(guān)節(jié)炎分期

項(xiàng)目來(lái)源:晉江市技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(編號(hào): 2011Z99)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是最常見(jiàn)慢性疾病之一，主要表現(xiàn)為患者關(guān)節(jié)疼痛，運(yùn)動(dòng)功能缺失，其主要病理特點(diǎn)為軟骨細(xì)胞修復(fù)不良和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞。研究證實(shí)，軟骨細(xì)胞退行改變是由于機(jī)械損傷與生物化學(xué)因子共同作用的結(jié)果，生物化學(xué)因子活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。我們通過(guò)檢測(cè)及分析2011 年7月至2013年6月，49例不同臨床分期的膝關(guān)節(jié)OA患者血清及關(guān)節(jié)液中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)，及抗氧化系統(tǒng)中總抗氧化能力T-AOC、氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的水平變化，評(píng)估氧化應(yīng)激指標(biāo)在臨床膝關(guān)節(jié)OA診治中的意義。

1　資料與方法

1.1一般資料2011年7月至2013年6月，收集安海醫(yī)院和福建醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院診治的膝關(guān)節(jié)OA患者49例(觀察組)，所有患者均滿足美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)膝關(guān)節(jié)OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)(ACR1995)［8］，依據(jù)臨床癥狀、體征及影像學(xué)表現(xiàn)分為四期。Ⅰ期:關(guān)節(jié)炎的發(fā)生前期，關(guān)節(jié)在活動(dòng)后稍有不適，活動(dòng)增加后伴有關(guān)節(jié)的疼痛及腫脹，在X線及CT檢查上看不到明顯軟骨損害跡象。Ⅱ期:關(guān)節(jié)炎改變的早期，活動(dòng)多后有明顯的疼痛，休息后減輕，X線觀察，改變較少，只有CT可見(jiàn)軟骨輕度損害，同位素檢查，被損關(guān)節(jié)可見(jiàn)凝聚現(xiàn)象。Ⅲ期:骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展期，骨軟骨進(jìn)一步損害，造成關(guān)節(jié)畸形，功能部分喪失，X線可見(jiàn)關(guān)節(jié)間隙變窄，關(guān)節(jié)周?chē)堑哪倚宰?，有時(shí)有游離體出現(xiàn)。Ⅳ期:骨關(guān)節(jié)炎的晚期，骨的增生、軟骨的剝脫以及導(dǎo)致功能完全喪失，關(guān)節(jié)畸形明顯，X線示關(guān)節(jié)間隙變窄，增生嚴(yán)重，關(guān)節(jié)變得粗大，甚至造成骨的塌陷。49例患者中，男24例，女41例;年齡47～85歲，平均年齡64歲;病程8～36個(gè)月，平均病程17.3個(gè)月;臨床分期為Ⅰ期者10例，Ⅱ期15例，Ⅲ期13例，Ⅳ期11例。排除標(biāo)準(zhǔn):凡有以下情形之一的患者均不予納入本次觀察: (1)有嚴(yán)重的心、肝、腎、肺等器官疾患; (2)惡性腫瘤患者; (3)診斷有炎性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、骨結(jié)核、骨髓炎或急性膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷及血管神經(jīng)損傷患者; (4)繼發(fā)性膝骨性關(guān)節(jié)炎患者; (5)孕婦或哺乳期女性; (6)精神疾病患者。所有患者對(duì)實(shí)驗(yàn)方案均知情同意，且得到醫(yī)院倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)。另選擇同時(shí)期我院16例健康體檢志愿者作為對(duì)照組，其中男7例，女9例;平均年齡61歲，均無(wú)膝痛病史，X線片排除膝關(guān)節(jié)病變。

1.2主要試劑和儀器－80℃超低溫冰箱(海爾)，超速低溫離心機(jī)(Allegra TM64R，Beckman)，低速離心機(jī)(TDL－50C，上海安亭科學(xué)儀器廠)，水浴恒溫器儀(HHS，上海醫(yī)療器械五廠)，752S分光光度儀(上海醫(yī)療器械六廠)，移液器(Appendorf公司); T-AOC、MDA、SOD和GSH檢測(cè)試劑盒均由南京建成公司提供，試劑盒變異系數(shù)＜15%。

1.3檢測(cè)方法血清標(biāo)本的采集與保存:所有受檢者均在安靜狀態(tài)下，清晨空腹抽取靜脈血5 ml。在采集后2 h內(nèi)，3 500 r/min，離心10 min，取上清液置于EP管中，－80℃冰箱保存待測(cè)。關(guān)節(jié)液標(biāo)本的采集與保存:取髕下外側(cè)入路行膝關(guān)節(jié)穿刺，首先注射0.9%氯化鈉溶液5 ml，關(guān)節(jié)屈伸活動(dòng)1 min后回抽2～3 ml于離心管中，3 500 r/min，離心10 min，取上清液置于EP管中，－80℃低溫冰箱保存待測(cè)。WST-1法測(cè)定SOD活性，化學(xué)法測(cè)T-AOC、MDA和GSH水平。所有檢測(cè)均按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組間的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，2組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般資料觀察組與對(duì)照組之間年齡、性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);體重指數(shù)觀察組明顯大于對(duì)照組(P＜0.01);與對(duì)照組相比，觀察組血清與關(guān)節(jié)液T-AOC，MDA均顯著增高(P＜0.01)，SOD、GSH顯著降低(P＜0.01)。見(jiàn)表1、2。

表1　2組基本臨床資料比較

表2　OA患者血清及關(guān)節(jié)液T-AOC、MDA與SOD、GSH變化±s

表2　OA患者血清及關(guān)節(jié)液T-AOC、MDA與SOD、GSH變化±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01

血清　關(guān)節(jié)液T-AOC　10.4±1.2　11.6±2.2　33.9±14.2*　40.0±16.6變量　對(duì)照組(n =16)OA組(n =49)血清　關(guān)節(jié)液* MDA(nmol/ml)　4.2±0.6　6.0±0.5　16.8±5.3*　11.6±4.5* SOD(U/ml)　125±13　176±21　67±8*　100±7* GSH(mg/ml)1 650±173　552±72　1 725±156　409±28

2.2血清及關(guān)節(jié)液T-AOC水平變化與對(duì)照組相比，觀察組Ⅰ期OA患者血清及關(guān)節(jié)液T-AOC水平即顯著升高，Ⅱ期兩者均進(jìn)一步升高，Ⅲ期與Ⅳ期之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但均較Ⅱ期高。見(jiàn)圖1、表3。

表3　5組血清和關(guān)節(jié)液觀察指標(biāo)比較±s

表3　5組血清和關(guān)節(jié)液觀察指標(biāo)比較±s

注:與正常對(duì)照比較，*P＜0.05，#P＜0.01;與Ⅰ期比較，△P＜0.05，與Ⅱ期比較，☆P＜0.05

血清　關(guān)節(jié)液正常對(duì)照(n =16)　10.4±1.2　11.6±2.2　4.2±0.6　6.0±0.5　125±13　17組別(分期)　T-AOC(μmol/ml)MDA(nmol/ml)SOD(U/ml)GSH(mg/ml)血清　關(guān)節(jié)液　血清　關(guān)節(jié)液　血清　關(guān)節(jié)液6±21　1 650±173　552±72Ⅰ期(n =10)　18.6±4.2*　25.1±4.1*　16.4±0.7#　6.2±0.9　75±10#　126±15#　1 725±156　653±103Ⅱ期(n =15)　30.2±5.1#△　31.6±6.4#△　15.6±1.3#　7.6±0.8*　74±11#　105±14#　1 683±165　715±99*Ⅲ期(n =13)　34.3±6.2#△　40.3±6.2#△　16.6±3.0#　13.5±2.2#△　68±14#　88±10#△　1 542±144　482±84＊☆Ⅳ期(n =11)　33.3±7.1#△　41.1±7.4#△　17.2±3.2#　12.6±2.4#△　63±9#　95±11#　1 605±172　325±51☆

圖1　不同臨床分期OA患者血清及關(guān)節(jié)液T-AOC水平變化

2.3血清及關(guān)節(jié)液MDA水平變化與對(duì)照組相比，觀察組血清MDA水平升高(P＜0.01)，各分期之間MDA差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而關(guān)節(jié)液中，觀察組MDA水平與臨床分期顯著相關(guān)，Ⅱ期OA患者較Ⅰ期MDA水平顯著升高，Ⅲ、Ⅳ期MDA水平進(jìn)一步升高，而兩期之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

圖2　不同臨床分期OA患者血清及關(guān)節(jié)液MDA水平比較

2.4血清及關(guān)節(jié)液SOD水平變化與對(duì)照組相比，觀察組OA患者血清SOD活力均明顯降低(P＜0.01)，各期間SOD活力水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而關(guān)節(jié)液中，OA患者SOD水平與臨床分期顯著相關(guān)，Ⅰ～Ⅳ期SOD水平逐漸下降，Ⅰ期患者SOD水平較對(duì)照組即明顯下降(P＜0.01)，Ⅱ期較Ⅰ期進(jìn)一步下降，Ⅲ、Ⅳ期之間SOD水平差異無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但均較Ⅱ期低(P＜0.01)。見(jiàn)圖3、表3。

圖3　不同臨床分期OA患者血清及關(guān)節(jié)液SOD活力比較

2.5血清及關(guān)節(jié)液GSH水平變化對(duì)照組與觀察組各分期血清GSH水平差異均無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);而關(guān)節(jié)液中，觀察組Ⅰ期OA患者GSH水平較對(duì)照組升高(P＜0.05)，至Ⅱ期GSH水平達(dá)到頂點(diǎn)(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ期GSH水平下降，均低于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)圖4、表3。

圖4　不同臨床分期OA患者血清及關(guān)節(jié)液SOD活力比較

3　討論

ROS包括超氧化物，過(guò)氧化氫，羥自由基及其代謝活性產(chǎn)物，過(guò)量ROS可介導(dǎo)細(xì)胞損傷，并參與細(xì)胞脂質(zhì)及蛋白氧化，DNA變性［1］; ROS參與OA的病理生理過(guò)程［2，3］。有研究報(bào)道，OA患者血清與關(guān)節(jié)液中ROS水平顯著增加，軟骨細(xì)胞脂質(zhì)氧化增強(qiáng)，OA患者后期關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌與修復(fù)功能呈進(jìn)行性退變;大量ROS主要攻擊的靶點(diǎn)為細(xì)胞膜不飽和脂肪酸脂質(zhì)氧化，促使細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能改變，并進(jìn)一步導(dǎo)致過(guò)氧化物沉積［4］; MDA作為脂質(zhì)氧化的重要產(chǎn)物，已廣泛應(yīng)用并反映ROS脂質(zhì)氧化水平，有報(bào)道證實(shí)在OA患者血清及關(guān)節(jié)液中ROS脂質(zhì)氧化異常［5］; SOD是對(duì)抗ROS的第一道防線，將ROS超氧陰離子歧化反應(yīng)成過(guò)氧化氫機(jī)體可減輕關(guān)節(jié)軟骨的氧化損傷［6］; GSH系統(tǒng)是抗氧化的重要組成，GSH通過(guò)酶性或非酶性的機(jī)制破壞ROS和其他自由基，降低ROS水平，其系統(tǒng)包括谷胱甘肽過(guò)氧化酶，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶及谷胱甘肽［6］。Mccord等［7］認(rèn)為在OA患者中抗氧化防御系統(tǒng)失常是導(dǎo)致關(guān)節(jié)氧化病理?yè)p傷重要因素，因而檢測(cè)患者血液和關(guān)節(jié)液氧自由基及抗氧化應(yīng)激指標(biāo)變化可間接判斷OA患者軟骨病變程度、預(yù)后以及對(duì)療效進(jìn)行合理評(píng)價(jià)。

過(guò)度的氧化應(yīng)激(oxidative stress)可促進(jìn)炎癥、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及破壞免疫耐受從而在自身免疫病的發(fā)展中起重要作用。多個(gè)研究者報(bào)道，OA中ROS水平的增高可能導(dǎo)致過(guò)氧化脂質(zhì)(LPO)反應(yīng)，軟骨細(xì)胞脂質(zhì)氧化增強(qiáng)，使LPO過(guò)氧化，MDA水平升高。本研究中的OA患者血清及關(guān)節(jié)液MDA水平均顯著升高;同時(shí)我們也觀察到，OA患者血清與關(guān)節(jié)液T-AOC均高于正常組，表明MDA與ROS總氧化水平有關(guān)。Maneesh等［8］也觀察到OA病人的血清MDA水平與T-AOC高于正常人群。因此，這些發(fā)現(xiàn)是OA中氧自由基產(chǎn)生關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷的可能證據(jù)。本研究又觀察到在不同OA臨床分期關(guān)節(jié)液T-AOC，MDA水平與臨床分期有直接的關(guān)系，即OA患者后期，T-AOC，MDA水平越高。因此，該指標(biāo)可用于臨床估計(jì)OA病情進(jìn)展或判定預(yù)后。但血清MDA無(wú)明顯變化，表明關(guān)節(jié)液MDA及氧化水平更能反映OA患者病情。本研究中的OA患者SOD活性顯著低于正常組。Karatas等［9］報(bào)道也證實(shí)抗氧化酶SOD活性在OA患者中顯著低于正常人群，認(rèn)為OA病人中SOD活性的降低可能與過(guò)量氧自由基有關(guān)。同樣，Kalpakcioglu等［10］證實(shí)過(guò)量的過(guò)氧化氫抑制SOD活性，而在OA患者總氧化能力增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致過(guò)氧化氫過(guò)度積累最終抑制SOD活性; Ostalowska等［11］報(bào)道，在原發(fā)性和繼發(fā)性膝OA患者的滑膜液中發(fā)現(xiàn)SOD活性增高;與此相反，Scott等［12］發(fā)現(xiàn)在OA關(guān)節(jié)中的滑膜液SOD沒(méi)有活性;這種不一致的原因可能與OA患者關(guān)節(jié)病變程度有關(guān)。在我們結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，關(guān)節(jié)液SOD活性與OA病情有明顯相關(guān)性。Pinto等［13］的研究表明，GSH在OA患者中沒(méi)有顯著的改變，而Scott等［12］發(fā)現(xiàn)OA患者關(guān)節(jié)液中的GSH水平增加。這種不一致的原因可能與對(duì)象來(lái)源不同有關(guān)。本結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，觀察組OA患者血清GSH水平無(wú)明顯降低(P＞0.05)，而關(guān)節(jié)液中顯著降低(P＜0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清GSH水平在不同分期患者中均無(wú)差別。而在關(guān)節(jié)液中，OA發(fā)病早期GSH水平呈反應(yīng)性增加，發(fā)病后期明顯下降，這種現(xiàn)象從側(cè)面上反映了不同臨床分期OA患者之間，關(guān)節(jié)液中GSH水平存在差異。該結(jié)果可能解釋了上述研究結(jié)果存在不同結(jié)論的現(xiàn)象。

總之，我們的研究揭示了不同臨床分期OA患者血清及關(guān)節(jié)液中氧化應(yīng)激指標(biāo)的波動(dòng)水平，這些指標(biāo)的波動(dòng)現(xiàn)象可作為臨床評(píng)估OA病情、判斷預(yù)后的依據(jù)。我們正進(jìn)一步探索氧化應(yīng)激指標(biāo)作為判定關(guān)節(jié)置換指征及評(píng)估置換時(shí)機(jī)的可行性。

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(收稿日期:2014－10－13)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.013

【文章編號(hào)】1002－7386(2015)06－0845－04

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 684.3