徐偉樂　馬輝　齊海亮　王娜　李輝

作者單位: 050041石家莊市，河北省胸科醫(yī)院微創(chuàng)外科

RANTES基因多態(tài)性與結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

徐偉樂馬輝齊海亮王娜李輝

作者單位: 050041石家莊市，河北省胸科醫(yī)院微創(chuàng)外科

【摘要】目的探討河北地區(qū)受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES)基因-403G/A和-28C/G單核苷酸多態(tài)性(SNP)與結(jié)核性膿胸的關(guān)系。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測(cè)300例結(jié)核性膿胸患者和300例對(duì)照人群RANTES基因-403G/A和-28C/G的基因型。結(jié)果RANTES基因-403G/A SNP基因型頻率和等位基因頻率在結(jié)核性膿胸組和正常組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004和P=0.008)，與GG基因型相比，攜帶AG+AA基因型可增加結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.403 95%，CI=1.015～1.939)。RANTES基因-28C/G SNP基因型頻率和等位基因頻率在結(jié)核性膿胸組和正常組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.128和P=0.064)，與CC基因型相比，攜帶CG+GG基因型與結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)(OR=1.314 95%，CI=0.891～1.936)。結(jié)論RANTES基因-403G/A SNP可能與結(jié)核性膿胸的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，即攜帶AG+AA基因型增加結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn); RANTES基因-28C/G SNP可能與結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核性膿胸; RANTES基因;單核苷酸多態(tài)性

E-mail: kk20140612@126.com

結(jié)核性膿胸為胸膜腔結(jié)核桿菌嚴(yán)重感染，并產(chǎn)生膿性滲出液積聚所致，發(fā)病率近年來呈上升趨勢(shì)。結(jié)核桿菌侵犯胸膜組織的過程，是由多種細(xì)胞因子參與的細(xì)胞免疫過程。受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(RANTES)作為重要的CC趨化因子，在炎癥部位募集和活化免疫細(xì)胞上扮演了重要角色，所以近年來RANTES基因受到人們關(guān)注［1］。本研究采用PCRRFLP的方法探討中國(guó)河北地區(qū)RANTES基因-403G/A和-28C/G SNPs與結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2011年1月至2014年1月于我院微創(chuàng)外科行手術(shù)治療的結(jié)核性膿胸患者300例為結(jié)核性膿胸組，術(shù)后標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，同時(shí)排除HIV感染者等免疫缺陷病患者，其中男165例，女13 例;平均年齡41.12歲。對(duì)照人群為同期在我院體檢中心健康體檢者300例(正常組)，其中男159例，女141例;平均年齡40.18歲。2組間年齡、性別比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1DNA的提取:取研究對(duì)象靜脈血5 ml，經(jīng)枸酸鈉抗凝，以蛋白酶消化-飽和氯化鈉鹽析法提取外周血白細(xì)胞DNA。

1.2.2PCR-RFLP技術(shù)分析: RANTES-403G/A和28C/G引物均參考文獻(xiàn)［2］設(shè)計(jì)，由上海伯昊生化科技有限公司合成。RANTES-403G/A上游引物序列: 5’CACAAGAGGACTCATTCCAACTCA-3’，下游引物序列: 5’-AGTTCCTGCTTATTCATTACAGATCGTA-3’-28C/G上游引物序列: 5’-ACTCCCCTTAGGGGATGCCCGT-3’，下游引物序列: 5’-GCGCAGAGGGCAGTAGCAAT-3’。擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃1 min、94℃變性20 s、退火溫度55℃30 s、72℃延伸30 s 35個(gè)循環(huán)后，最后72℃延伸7 min，循環(huán)數(shù)30。RANTES-403G/A 和-28C/G擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶RsaI和HincII酶切，酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在紫外成像儀下觀察、拍照并分析其結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，正常對(duì)照組基因型頻率分布行χ2檢驗(yàn)做Hardy-Weinberg平衡分析，基因型和等位基因頻率分布比較采用χ2檢驗(yàn)，以非條件Logistic回歸方法計(jì)算表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度的比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1基因型分析RANTES-403G/A位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為206 bp，酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，AA基因型僅見一條206 bp電泳帶，AG基因型顯示為206 bp、180 bp和26 bp三條帶，GG基因型表現(xiàn)為180 bp和26 bp兩條帶。-28C/G位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為175 bp，酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，GG基因型僅見一條175 bp電泳帶，CG基因型可見三條帶分別為175 bp、152 bp和23 bp，CC基因型表現(xiàn)為152 bp和23 bp兩條帶。見圖1、2。

圖1　RANTES-403G/A位點(diǎn)酶切圖

圖2　RANTES-28C/G位點(diǎn)酶切圖

2.2正常組情況正常組的-403G/A和-28C/G位點(diǎn)的基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P＞ 0.05)。

2.3RANTES-403G/A SNP基因型和等位基因頻率分布在結(jié)核性膿胸組和正常組比較該位點(diǎn)各基因型頻率和等位基因型頻率在結(jié)核性膿胸組和正常組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004和P=0.008)。與G基因型相比，攜帶AG+AA基因型可增加結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.403 95%，CI=1.015～1.939)。見表1、2。

表1　RANTES-403G/A基因型和等位基因頻率在結(jié)核性膿胸組和正常組中比較　n=300，例(%)

表2　RANTES-403G/A SNP與結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系n=300，例(%)

2.4RANTES-28C/G SNP基因型和等位基因頻率分布在結(jié)核性膿胸組和正常組比較該位點(diǎn)各基因型頻率和等位基因頻率在結(jié)核性膿胸組和正常組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.128和P=0.064)，與CC基因型相比，攜帶CG+GG基因型與結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)(OR=1.314 95%，CI=0.891～1.936)。見表3、4。

表3　RANTES-28C/G基因型和等位基因頻率在結(jié)核性膿胸組和正常組中比較　n=300，例(%)

表4　RANTES-28C/G SNP與結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系n=300，例(%)

3　討論

RANTES基因定位于人染色體17q11.2～12，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其存在多個(gè)SNP位點(diǎn)，其中，位于啟動(dòng)子區(qū)的-403G/A和-28C/G SNPs可能會(huì)影響RANTES基因的表達(dá)水平和功能活性，從而影響機(jī)體對(duì)疾病的易感性［1］。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于其多態(tài)性與結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系已有報(bào)道，結(jié)論不盡一致。對(duì)于RANTES-403G/A SNP，Mishra等［3］發(fā)現(xiàn)在印度中北部Sahariya部落中-403G/A SNP與肺結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯相關(guān)，攜帶A等位基因增加肺結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，這與Sánchez-Castaňón等［4，5］研究結(jié)果一致。而Selvaraj等［6］通過對(duì)印度南部人群-403G/A SNP研究，發(fā)現(xiàn)-403G/A SNP與肺結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)，Chu等［7］對(duì)中國(guó)香港人群的研究和Mhmoud等［2］對(duì)蘇丹人群的研究得到相同結(jié)論，隨瑞枝［8］也報(bào)道了寧夏地區(qū)人群中此多態(tài)位點(diǎn)與結(jié)核病發(fā)病可能無(wú)關(guān)。對(duì)于RANTES-28C/G SNP，報(bào)道顯示在印度中北部Sahariya部落［3］和中國(guó)香港人群中［7］，此位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)，而在西班牙北部人群［4］、突尼斯人群［5］和蘇丹人群中［2］，-28C/G SNP與肺結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯相關(guān)，攜帶G等位基因增加肺結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。出現(xiàn)上述結(jié)論不一致的原因，考慮與RANTES-403G/A和-28C/G SNPs在不同人群、種族分布的多樣性及地域分布密切相關(guān)。上述報(bào)道多以肺結(jié)核患者為研究對(duì)象，關(guān)于RANTES-403G/A和-28C/G SNPs與結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，筆者尚未見報(bào)道。本文研究發(fā)現(xiàn)，RANTES-403G/A SNP可能與結(jié)核性膿胸的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，即攜帶AG+AA基因型(A等位基因)增加結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而-28C/G SNP可能與結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。

結(jié)核性膿胸的發(fā)病是一個(gè)多因素參與的錯(cuò)綜復(fù)雜的過程，易感基因多態(tài)性是其中一個(gè)因素。進(jìn)一步研究不同易感基因獨(dú)立或聯(lián)合在結(jié)核性膿胸遺傳易感性中的作用，對(duì)闡明結(jié)核性膿胸的發(fā)生機(jī)制和結(jié)核性膿胸的防治具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)

1王興，隨瑞枝，張淑雅，等.寧夏回漢族人群RANTES基因多態(tài)性的分布特征.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34: 676-679.

2Mhmoud N，F(xiàn)ahal A，Wendy W，et al.Association of IL-10 and CCL5 sin gle nucleotide polymorphisms with tuberculosis in the Sudanese popula tion.Tropical Medicine and International Health，2013，18: 1119-1127.

3Mishra G，Poojary SS，Raj P，et al.Genetic polymorphisms of CCL2 CCL5，CCR2 and CCR5 genes in Sahariya tribe of North Central India: a association study with pulmonary tuberculosis.Infect.Genet Evol，2012 12: 1120-1127.

4Sánchez-Castaňón M，Baquero IC，Sánchez-Velasco P，et al.Polymor phisms in CCL5 promoter are associated with pulmonary tuberculosis i northern Spain.Int J Tuberc Lung DIS，2009，13: 480-485.

5Ben-Selma W，Harizi H，Bougmiza I，et al.Polymorphisms in the RAN TES gene increase susceptibility to active tuberculosis in Tunisia.DN and Cell Biology，2011，30: 789-800.

6Selvaraj P，Alagarasu K，Singh B，et al.CCL5 (RANTES) gene polymor phisms in pulmonary tuberculosis patients of south India.Int J Immuno genet，2011，38: 397-402.

7Chu SF，Tam CM，Wong HS，et al.Association between CCL5 function polymorphisms and tuberculosis in Hong Kong Chinese.Genes Immun 2007，8: 475-479.

8隨瑞枝.CCL5基因多態(tài)性與寧夏地區(qū)結(jié)核病遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性研究.寧夏醫(yī)科大學(xué).2011.

The correlation between RANTES gene polymorphism and the onset risk of tuberculous empyema

XU Weile，MA Hui，QI Hailiang，et al.
Minimally Invasive Surgery of Hebei Chest Hospital，Shijiazhuang 050041，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation between RANTES-403G/A and-28C/G single nucleotide polymorphism (SNPs) and the onset risk of tuberculous empyema (TE) in Hebei Province，China.Methods The gene types of SNPs of RANTES-403G/A and-28C/G were detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) in 300 patients with tuberculous empyema (patient group) and 300 healthy subjects (control group).Results

There were significant differences in genotype frequency and allele frequency of RANTES-403G/A SNP between the two groups (P=0.004，0.008，respectively).As compared with GG genotype，the AG+GG genotype could increase the onset risk of tuberculous empyema (OR=1.403 95%，CI=1.015～1.939).However there were no significant differences in genotype frequency and allele frequency of RANTES-28C/G between the patient group and control group (P=0.128，0.064，respectively).As compared with the CC genotype，the CG+GG genotype was not correlated to onset risk of TE (OR=1.314 95%，CI=0.891～1.936).Conclusion The RANTES-403G/A SNP may be correlated to onset risk of TE，carrying G allele (AG+GG) may increase onset risk of TE.However 28C/G SNP may be not related with onset risk of TE.

【Key words】tuberculous empyema; RANTES gene; single nucleotide polymorphism

(收稿日期:2014－11－20

通訊作者:李輝，050041石家莊市，河北省胸科醫(yī)院微創(chuàng)外科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.008

【文章編號(hào)】1002－7386(2015) 09－1311－03

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】R 561.6