郎遙玲管曉燕白國輝劉建國

（1.遵義醫(yī)學(xué)院口腔學(xué)院，遵義　563000；2.貴州省高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c實驗室，遵義　563000）

轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因去除方法的研究進(jìn)展

郎遙玲1，2管曉燕1，2白國輝2劉建國1，2

（1.遵義醫(yī)學(xué)院口腔學(xué)院，遵義563000；2.貴州省高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c實驗室，遵義563000）

隨著越來越多的轉(zhuǎn)基因植物品種的出現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全及食用安全越來越受到人們的廣泛關(guān)注。目前存在的問題之一是轉(zhuǎn)基因植物中抗生素或除草劑抗性的選擇標(biāo)記基因的存留。為了提高轉(zhuǎn)基因植物的安全性，將轉(zhuǎn)基因植物中選擇性標(biāo)記基因去除，不僅利于同一轉(zhuǎn)基因植物的多次操作，而且更容易被人們所接受。就目前轉(zhuǎn)基因植物中選擇性標(biāo)記基因去除的方法及其優(yōu)缺點進(jìn)行了橫縱向的比較，希望對相關(guān)研究領(lǐng)域方法的選擇方向具有指導(dǎo)意義。

轉(zhuǎn)基因植物；選擇性標(biāo)記基因；安全性

自1983年美國科學(xué)家首次探索并獲得了轉(zhuǎn)基因煙草以來，轉(zhuǎn)基因植物受到了人們的廣泛關(guān)注。1996年，首次開展轉(zhuǎn)基因植物的商業(yè)化種植，至今全球已有28個國家及地區(qū)累計批準(zhǔn)25種轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，包括以抗除草劑和抗蟲為主的玉米、大豆、油菜及棉花等。2014年，轉(zhuǎn)基因植物種植面積已達(dá)1.815億hm2。轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全及食用安全成為當(dāng)今研究的熱點。目前，植物遺傳轉(zhuǎn)化都要使用選擇標(biāo)記基因（Marker gene），這一基因被眾多研究者運用得較為廣泛，其主要是除草劑抗性和編碼抗生素的基因。但是當(dāng)轉(zhuǎn)化完成后，選擇標(biāo)記基因?qū)テ涫褂玫膬r值，它的保留被認(rèn)為是不可取的。因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用出現(xiàn)了一大難題，即如何去除選擇性標(biāo)記，且不含抗性標(biāo)記。標(biāo)記基因的安全性問題主要表現(xiàn)在：標(biāo)記基因是否會傳播到野生親緣品種中，導(dǎo)致雜草獲得此抗性后變成現(xiàn)有的除草劑殺滅不了的“超級雜草”；標(biāo)記基因?qū)θ祟悪C體能否產(chǎn)生毒物、抗?fàn)I養(yǎng)的因子及潛在過敏原性；現(xiàn)有生態(tài)環(huán)境的平衡是否被破壞；抗生素的抗性基因轉(zhuǎn)移到微生物中，使病原菌獲此抗性，導(dǎo)致臨床運用的抗生素?zé)o效。此外，同源依賴的基因沉默H（Homology—dependent gene silencing）可能會被選擇性標(biāo)記基因存在的結(jié)構(gòu)所誘導(dǎo)，從而使轉(zhuǎn)基因植物的遺傳改良以失敗告終。所以，在轉(zhuǎn)基因植物中提高其安全性的有效手段之一是培育無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物，其中的有效策略是采取一系列措施在轉(zhuǎn)化植株篩選完成后將選擇標(biāo)記基因去除。構(gòu)建能去除選擇標(biāo)記基因的方法目前有共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)法、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)法、位點特異性重組系統(tǒng)法、重組酶系統(tǒng)法、外源基因清除技術(shù)及葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)等，下面對這些方法及其優(yōu)缺點進(jìn)行簡要介紹［1-4］。

1 標(biāo)記基因去除方法

1.1 共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)法

最早研究的去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇性標(biāo)記基因的方法是共轉(zhuǎn)化法。共轉(zhuǎn)化法指的是兩個質(zhì)粒上分別插入標(biāo)記基因和目的基因，或?qū)?biāo)記基因和目的基因組裝在一個質(zhì)粒的兩個不同的T-DNA區(qū)段上，同時進(jìn)行轉(zhuǎn)化。T-DNA插入是隨機進(jìn)行的，因此，標(biāo)記基因和目的基因可同時插入同一細(xì)胞不同的染色體上，經(jīng)后代遺傳重組使兩個基因分離，獲得只含有目的基因而無標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植株［5］。

目前最常見的兩種轉(zhuǎn)化方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法和基因槍介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法有3種，分別是一質(zhì)粒一菌株法、二質(zhì)粒一菌株法和二質(zhì)粒二菌株法?，F(xiàn)研究得較多的是一質(zhì)粒一菌株法。共轉(zhuǎn)化法已經(jīng)成功運用于水稻、煙草、大麥和玉米等植物中。2013年，Kapusi等［2］利用共轉(zhuǎn)化將同時攜帶選擇標(biāo)記基因和效應(yīng)基因的后代中分離去除選擇標(biāo)記基因，同時還指出加倍單倍體技術(shù)可以廣泛的應(yīng)用于傳統(tǒng)的大麥育種計劃，它是一個有用且固定的轉(zhuǎn)基因方法，同時除去不需要的選擇性標(biāo)記基因。Komari等［6］將gus基因和hpt基因運用共轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入水稻和煙草中，經(jīng)后代分離之后，不含標(biāo)記基因gus的轉(zhuǎn)基因植株大于50%。Miller等［7］運用共轉(zhuǎn)化的方法，對含雙T-DNA超二元質(zhì)粒載體進(jìn)行實驗操作，最后得出結(jié)論：運用共轉(zhuǎn)化法能獲得轉(zhuǎn)化效率為93.4%的無標(biāo)記基因。基因槍介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法是一個有效的方法，Romano等［8］通過基因槍介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法得到了無標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。Shiva Prakash等［9］采用相同的方法，獲得了大量單拷貝的無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因玉米。

共轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點是：方法簡單，易于操作。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法整合的位點比較穩(wěn)定且拷貝數(shù)較低，機理清楚，適用范圍廣，穩(wěn)定性較好，整合后的外源基因變異較小，較容易產(chǎn)生非連鎖位點等特點?；驑尳閷?dǎo)的共轉(zhuǎn)化法去除標(biāo)記基因的同時，減少骨架序列整合，并且不受材料基因型的控制。運用共轉(zhuǎn)化法去除轉(zhuǎn)基因植物中的標(biāo)記基因應(yīng)用中注意問題有3個方面：后代植株通過自交或雜交出現(xiàn)分離、轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化效率較高、T-DNA整合到不連鎖位點。共轉(zhuǎn)化法不足有：（1）需要利用有性雜交，將目的基因與標(biāo)記基因分離，從而限制了共轉(zhuǎn)化法在無性繁殖植物及生殖時間較長的物種中的運用。（2）此種方法轉(zhuǎn)化效率較低，工作量大，費時，限制了共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。（3）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化存在骨架系列整合及基因型限制的情況。（4）基因槍介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法存在沉默、遺傳穩(wěn)定及拷貝數(shù)多等問題。

1.2 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)法

轉(zhuǎn)座子是一段可移動的、可自我復(fù)制的DNA序列，其存在于染色體DNA中。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)指的是將轉(zhuǎn)座子與目的基因或者標(biāo)記基因相連接，轉(zhuǎn)座子在移動的過程中，將目的基因與標(biāo)記基因分離，子代植株通過遺傳的分離得到只帶有目的基因的轉(zhuǎn)基因植株。因此，利用轉(zhuǎn)座子方法可培育無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物。Andrew等［10］運用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的再定位法，使目的基因再定位，從而獲得無標(biāo)記基因的植物。John等［11］運用同樣的方法將選擇性標(biāo)記基因去除。目前，轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)法用于去除標(biāo)記基因的研究主要是Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，來源于玉米，是構(gòu)建插入型突變體庫的理想技術(shù)。該系統(tǒng)在油菜運用中處于起步階段，在水稻和擬南芥中運用較為廣泛［12］。Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在擬南芥中活性較高，在配子期轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)Ds的轉(zhuǎn)座頻率高達(dá)68%［13］。

與其他方法相比，Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)主要的優(yōu)點是：轉(zhuǎn)化體中不攜帶T-DNA及其他非冗余序列，能獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)位后再插入對目的基因的表達(dá)無影響。但轉(zhuǎn)座子法仍有不利于廣泛運用的缺點：不僅不能實現(xiàn)當(dāng)下比較熱門的多基因聚合，而且轉(zhuǎn)座子法還不適于無性繁殖的作物。此外，大部分植物中存在大量不同效率的轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)座切除的不精確性、耗時費力，以及后代出現(xiàn)突變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)座的效率不如人意，使轉(zhuǎn)座子方法的運用漸漸減少。

1.3 位點特異性重組系統(tǒng)法

與轉(zhuǎn)座作用相比，位點特異性重組系統(tǒng)法在轉(zhuǎn)基因植物標(biāo)記基因去除過程中具有刪除高效精確、轉(zhuǎn)化周期短等特點，在近年來的轉(zhuǎn)基因工程研究中被廣泛運用。重組是既能把外源的基因整合到染色體上，又能把染色體上的外源基因去除的方法。位點特異性重組系統(tǒng)法是指在DNA專一性的位點間通過重組酶的作用而實現(xiàn)同源之間的雙向交換。該方法由兩個關(guān)鍵點組成，即識別位點和重組酶。重組酶可以催化由正向排列的兩個識別位點之間的序列，從而將標(biāo)記基因去除。位點特異性重組系統(tǒng)法包括：FLP/FRTS系統(tǒng)、 FLP/frt系統(tǒng)法和R/RS系統(tǒng)法、Cre/lox系統(tǒng)法和Gin/gix系統(tǒng)法等。目前，被廣為接受及運用較多的是Cre/lox系統(tǒng)法。

1.3.1 FLP/FRTs系統(tǒng)和 FLP/frt系統(tǒng)法 去除轉(zhuǎn)基因植物選擇標(biāo)記基因的方法中，來源于啤酒酵母的FLP/FRTs系統(tǒng)被最先利用。如今已被廣泛運用于水稻、煙草及擬南芥等真核植物的研究，誘導(dǎo)基因去除、插入及置換［14］。

FLP/FRTs系統(tǒng)法是指FRTs序列之間的DNA片段被FLP重組酶催化并重組。2010年，Li等［15］利用FLP/FRTs系統(tǒng)去除乙酰乳酸合成酶選擇標(biāo)記基因，刪除效率為40.7%。同年，F(xiàn)ladung等［16］運用同樣的方法使轉(zhuǎn)化再生植物成功的去除FLP和nptⅡ基因，其刪除效率為65.2%。Cregg 等［17］證明了FRTs之間的Arg基因可被酵母的FLP重組酶作用，他們將Arg+FRT結(jié)構(gòu)引入Arg-酵母當(dāng)中，并經(jīng)過篩選得到了Arg+轉(zhuǎn)化株，將FLP引入轉(zhuǎn)化子中經(jīng)過二次轉(zhuǎn)化實驗并又得到了Arg-轉(zhuǎn)化子。此外，F(xiàn)LP/FRTs系統(tǒng)重組法在煙草中的同向定點重組位點frt之間的基因去除效率在19%-47%之間。FLP/frt重組系統(tǒng)中FLP重組酶能夠催化同一分子當(dāng)中的兩個同向之間的位點，并去除DNA片段。重組功能已經(jīng)在煙草、玉米細(xì)胞等實驗中得以驗證。單曉呋等［4］利用多個步驟的重組，建立了能廣泛運用于植物當(dāng)中的FLP/frt重組系統(tǒng)，通過二次轉(zhuǎn)化的方法將兩者先后轉(zhuǎn)入煙草中并熱激處理，引發(fā)重組反應(yīng)，結(jié)果顯示選擇標(biāo)記基因als有41%被有效去除。FLP/FRTs系統(tǒng)法的刪除精確性較高，但因二次轉(zhuǎn)化需建立一個高效的遺傳再生體系，轉(zhuǎn)化效率較低，大大限制了二次轉(zhuǎn)化的運用。此外，有性雜交方法不適用于無性繁殖的植物，其工作量較大、周期長、不受人為控制等限制其在轉(zhuǎn)基因植物中的運用。

1.3.2 R/RS系統(tǒng) R/RS系統(tǒng)法源于接合酵母的SR1質(zhì)粒，能專一識別特有的RS識別序列的重組酶，并使兩個相鄰的RS之間的DNA片段去除。2011年，Khan等［18］采用R/RS系統(tǒng)法得到了不含有ipt選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因番茄。Saelim 等［19］運用R/RS系統(tǒng)法對木薯處理轉(zhuǎn)化，無選擇標(biāo)記基因的木薯占到88%-96%。Sugita等［20］通過R/RS系統(tǒng)與 MAT載體系統(tǒng)結(jié)合，明顯提高了無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物（MFTPs）的產(chǎn)生頻率。

與共轉(zhuǎn)化法需要利用有性雜交相比，MAT載體系統(tǒng)具有無需有性雜交過程就可將選擇性標(biāo)記基因去除等優(yōu)點，從而獲得MFTP。這種方法可用于無性繁殖植物，使對某些植物進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化變?yōu)楝F(xiàn)實。R/RS系統(tǒng)法與FLP/FRTs系統(tǒng)法相比，其優(yōu)點：標(biāo)記基因在去除過程中無需二次轉(zhuǎn)化，適合無性繁殖的植物。其缺點：往往會在重組位點上留下一個識別的序列，使位點特異性重組系統(tǒng)法在受體植物中的多次運用受到限制。此外，如經(jīng)歷多次標(biāo)記基因去除，可能存在多拷貝的識別序列導(dǎo)致基因沉默。

1.3.3 Cre/lox 系統(tǒng) Cre/lox系統(tǒng)是目前運用最廣泛、研究最深入的位點特異性重組系統(tǒng)法［21］。Cre/lox系統(tǒng)來自大腸桿菌噬菌體P1，于1981年被首次發(fā)現(xiàn)，因間隔區(qū)的非對稱使lox 位點具有方向性。根據(jù)兩個lox 位點的方向不同，其作用方式有3種：一是當(dāng)兩個 lox 位點不位于同一分子上時，將會導(dǎo)致DNA片段發(fā)生易位；二是當(dāng)兩個lox位點的作用方向相反時，重組反應(yīng)會使lox位點間的DNA片段倒位；三是當(dāng)兩個位點的作用方向相同時，重組反應(yīng)會使lox 位點間的 DNA片段去除。因此，在兩個相同方向的34 bp大小的lox序列之間被Cre重組酶催化使重組發(fā)生，能使lox序列間的基因片段切除。Zuo等［22］將Cre/lox系統(tǒng)與化學(xué)誘導(dǎo)植物的表達(dá)系統(tǒng)（即XVE系統(tǒng)）相結(jié)合，形成另一種標(biāo)記基因去除系統(tǒng)CLX系統(tǒng)（Cre/loxP DNA excision system），結(jié)果顯示：CLX對受體植物的標(biāo)記基因，包括重組酶基因cre、標(biāo)記基因npt II、XVE，經(jīng)β-雌二醇誘導(dǎo)后切除的效率達(dá)到了100%。此方法的優(yōu)點：能運用于無性繁殖的植物中，精確的控制切除時間，不依賴ipt表型而進(jìn)行篩選，以及通過構(gòu)建合適的載體可以再生無標(biāo)記基因的單拷貝植物。這是轉(zhuǎn)基因植物工程中的一種較為理想化的方法。

有研究報告顯示：Cre/lox重組法使用pX6載體進(jìn)行篩選，結(jié)束之后雌二醇誘導(dǎo)Cre操縱子，合成切割重組，該重組是由 Cre蛋白介導(dǎo)lox位點，運用Cre/lox系統(tǒng)法能將標(biāo)記基因去除［23］。郭霞等［24］運用了loxP位點識別系統(tǒng)，該系統(tǒng)能定向去除潮霉素抗性標(biāo)記基因，他們運用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt抗蟲基因成功的導(dǎo)入“晚粳97”（安徽主栽水稻品種）中，獲得的loxp-hpt-loxp-Bt轉(zhuǎn)基因水稻植株可以與帶有Cre基因的水稻進(jìn)行雜交，從而去除了潮霉素抗性選擇標(biāo)記基因。2011年，Khattri等［25］將大豆熱休克啟動子控制Cre基因?qū)胨净蚪M，Cre介導(dǎo)的重組能夠去除標(biāo)記基因。蘆春斌等［26］將番茄的Marker-Free系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，同時表達(dá)HPV16目的基因、E6、E7，轉(zhuǎn)化之后可以將標(biāo)記基因去除。同年，尚玉花等［27］利用該系統(tǒng)方法將轉(zhuǎn)Bt基因水稻中的選擇性標(biāo)記基因去除。2012年，Chong-Perez等［28］利用Cre-lox位點特異性重組系統(tǒng)，熱休克誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因香蕉，將可選擇的標(biāo)記基因去除。這是第一次報告對香蕉有效去除標(biāo)記基因的系統(tǒng)。

Cre/lox系統(tǒng)法因其精確性及可預(yù)知性使人們能夠?qū)蜻M(jìn)行定向、定點操作，成為轉(zhuǎn)基因植物研究產(chǎn)品商業(yè)化的有效工具。運用該系統(tǒng)需注意的問題：Cre基因的高度表達(dá)，可能會使基因重排；可能含有一部分假的、潛在的lox 位點，與野生型位點有部分的同一性，在野生型重組的介導(dǎo)下能表現(xiàn)出活力；去除不徹底導(dǎo)致產(chǎn)生嵌合體的現(xiàn)象。

1.3.4 Gin/gix系統(tǒng) Gin/gix系統(tǒng)法是指在兩個Gix特異位點之間，在重組酶Gin作用下切除的全過程，是1991年由Maseser等［29］發(fā)現(xiàn)的。Gin/gix系統(tǒng)法的缺點是對植物的再生造成負(fù)面的影響，植物的應(yīng)用中相關(guān)文獻(xiàn)鮮見報道。

1.4 重組酶系統(tǒng)

自從重組酶系統(tǒng)Cre/loxp在煙草植物中轉(zhuǎn)化成功以來，科學(xué)家們已嘗試將重組酶系統(tǒng)運用到玉米、水稻和大麥等多種植物當(dāng)中［30］。重組酶系統(tǒng)法指的是一種針對轉(zhuǎn)入基因進(jìn)行的組織特異性及定點操作的一種基因重組系統(tǒng)法，重組酶系統(tǒng)能夠有效的進(jìn)行基因整合性刪除、染色體易位及條件性重組等。因此，可以將重組酶系統(tǒng)運用在轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域。2013年，Zou等［31］從根癌農(nóng)桿菌構(gòu)建異戊烯基基因（IPT）的選擇標(biāo)記基因和兩側(cè)由兩個loxP位點直接定位的Cre重組酶基因，一種新的基于Cre/loxP位點重組系統(tǒng)從轉(zhuǎn)基因柑橘中去除選擇性標(biāo)記基因。分析表明，在轉(zhuǎn)基因植物中觀察到100%的刪除效率。這種方法提供了從轉(zhuǎn)基因柑橘中生產(chǎn)無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的一種可靠策略。同年，García-Almodóvar等［32］構(gòu)建（px6-dao1）化學(xué)誘導(dǎo)的Cre-loxP系統(tǒng)和選擇的標(biāo)記基因dao1來獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因煙草。運用Cre/loxp重組酶系統(tǒng)具有時間和空間特異性、高效性、準(zhǔn)確性及快速性等特點，因此擁有的重組方式可以去除特定基因［30］。但重組酶系統(tǒng)技術(shù)存在不足，要獲得完整的重組酶系統(tǒng)需要二次轉(zhuǎn)化或雜交等，耗時較長。此外，R/RS重組酶也可用于轉(zhuǎn)基因植物中。2014年，Righetti等［33］用化學(xué)誘導(dǎo)的R/RS重組酶將轉(zhuǎn)基因蘋果和梨的nptII標(biāo)記基因去除。

噬菌體phiC31位點重組酶系統(tǒng)是繼FLP/frt重組酶系統(tǒng)和Cre/lox重組酶系統(tǒng)后又一新型位點的重組酶系統(tǒng)，在真核和原核生物中廣泛應(yīng)用。phiC31位點重組酶系統(tǒng)已在多種植物中得到驗證。在植物中應(yīng)用注意可能會出現(xiàn)去除不徹底的問題，可能與植物中相應(yīng)的phiC31重組酶表達(dá)量太低有關(guān)。phiC31重組酶系統(tǒng)與其他類型的重組系統(tǒng)相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)農(nóng)作物外源基因的精確調(diào)控，將會是未來的重點研究方向之一［34］。

近年來開展了由重組酶介導(dǎo)的盒式交換重復(fù)基因打靶（RMCE）的研究，它是高可預(yù)測性以及基因表達(dá)重復(fù)性的一種有效工具，用于基因的功能和調(diào)控研究［35］。已經(jīng)開發(fā)了定點整合（SDI）載體系統(tǒng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，SDI在沒有任何共表達(dá)的選擇標(biāo)記基因條件下，精確地整合目的基因的單一拷貝到一個特定的染色體位點上，通過隨機整合拷貝的去除，可以有效地增加RMCE，針對性地選擇無標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物。

1.5 兩種重組系統(tǒng)的運用

1.5.1 外源基因清除技術(shù) 外源基因清除技術(shù)（Gene deletor）是美國康涅狄格大學(xué)華裔教授率先發(fā)展起來，為解決轉(zhuǎn)基因植物安全性問題的有效工具。外源基因清除技術(shù)［36］指的是在基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體系統(tǒng)中引入酵母的重組酶系統(tǒng)與細(xì)菌的噬菌體（即構(gòu)建Cre/LoxP和FLP/FRT雙重組系統(tǒng)），在轉(zhuǎn)基因植物中特異性的表達(dá)，由特異的啟動子驅(qū)動FLP/Cre的重組酶基因，根據(jù)研究的目標(biāo)可以將局部或整體的轉(zhuǎn)基因植物的所有目的基因去除。不管是共轉(zhuǎn)化法、轉(zhuǎn)座子法，還是位點特異性重組系統(tǒng)法等等，仍然可能存在植物中的外源目的基因通過花粉逃逸在周圍其他的物種中，引發(fā)的安全性問題仍然存在。與其他方法相比，外源基因清除技術(shù)可以去除轉(zhuǎn)基因植物中幾乎所有的標(biāo)記基因和目的基因。此外，外源基因清除技術(shù)可同時運用于有性和無性的繁殖中，解決了R/RS系統(tǒng)法只適合于無性繁殖植物的局限性問題，也解決了FLP/FRTs系統(tǒng)法去除選擇性標(biāo)記基因效率較低的問題。但是外源基因清除技術(shù)存在不足，在特異的啟動子驅(qū)動FLP/Cre的重組酶基因去除外源基因的同時，基因組中仍有一段序列存留。雖然影響不大，但是仍有待完善。

1.5.2 其他技術(shù) 2011年，鄒璐琳等［37］同時運用了Cre/Lox系統(tǒng)和FLP/frt系統(tǒng)的兩種重組系統(tǒng)方法培育了去除選擇性標(biāo)記基因的耐寒轉(zhuǎn)基因植物，該方法成功構(gòu)建了一個能夠高效去除選擇性標(biāo)記基因的Bhlea2基因植物表達(dá)載體。2012年，Nandy等［38］運用FLPe/frt系統(tǒng)的位點特異性基因進(jìn)行整合，去除水稻中的標(biāo)記基因。該方法解決了外源基因隨花粉漂移的問題，同時為食用組織部分去除目的基因提供了有效的方法。但是，目的基因的去除不利于轉(zhuǎn)基因植物留種，并且需要分離受體植物種子或花粉的特異性啟動子。因此，該方法在轉(zhuǎn)基因植物研究及商業(yè)化運用方面受到一定的限制。

通過異源位點特異性重組酶（Site-specific recombinase，SSR）系統(tǒng)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因整合，已在幾種不同的植物物種中得以證實。植物轉(zhuǎn)化的方法產(chǎn)生一個精確的定點整合（Site-specific integration，SSI）結(jié)構(gòu)，由一個單拷貝的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建。由于SSR系統(tǒng)是轉(zhuǎn)基因位點去除標(biāo)記基因的一種有效工具，較早前已被提出，分別由不同的重組系統(tǒng)介導(dǎo)。SSI線路中無選擇標(biāo)記基因的的第一代本身被開發(fā)出來，更重要的是后代從這些線路中派生，繼承了無選擇的標(biāo)記基因的特性。這種方法適用于簡化生產(chǎn)的無選擇標(biāo)記的SSI生產(chǎn)路線。

1.6 葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)

葉綠體是植物細(xì)胞中由雙層膜圍成，含有葉綠素能進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器。葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)指的是將轉(zhuǎn)基因插入到葉綠體的基因組中。葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)主要有3種策略：一是運用同源重組的方式將外源基因特異重組到葉綠體基因組中；二是運用葉綠體5'-UTR和3'-UTR區(qū)序列、特異性啟動子及終止子，使目的基因能在葉綠體高表達(dá)［39］；三是篩選標(biāo)記基因使外源基因能在葉綠體基因中實現(xiàn)同質(zhì)化［40］。因母系遺傳是大多數(shù)植物葉綠體的遺傳方式，當(dāng)外源基因整合到葉綠體基因組，極少會出現(xiàn)外源基因隨著花粉轉(zhuǎn)移擴散到周圍的環(huán)境中，可以解決標(biāo)記基因傳播到野生親緣品種中導(dǎo)致雜草獲得此抗性的危險。此外，目的基因表達(dá)有葉片組織的特異性，所以幾乎不會在轉(zhuǎn)基因植物的果實中大量累積。葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)適合于原核和真核植物基因的表達(dá)、外源基因高效表達(dá)，可進(jìn)行多基因轉(zhuǎn)化，不易產(chǎn)生基因沉默。因此，葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用具有廣闊的前景。1988年，人類首次成功運用葉綠體DNA轉(zhuǎn)化衣藻突變體。2011年，Day等［41］報道了在廣泛的植物種類中，葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)被證實是可行的，高效的標(biāo)記基因去除方法是質(zhì)體工程之中的一大亮點。但目前仍有一些問題尚未完全解決：一是細(xì)胞核與葉綠體間的基因流動問題；二是葉綠體DNA穩(wěn)定性問題。

2 展望

為解決全球不斷增長的糧食需求、保障經(jīng)濟可持續(xù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因植物商業(yè)化種植的環(huán)境安全以及食用安全仍會繼續(xù)成為當(dāng)今的焦點。研究者探索了不同的技術(shù)策略來保障轉(zhuǎn)基因植物的安全性，出現(xiàn)多種多樣的去除轉(zhuǎn)基因植物中的選擇性標(biāo)記基因的方法，為確保安全高效的去除標(biāo)記基因的技術(shù)具有重要的意義。以上所述的轉(zhuǎn)基因植物標(biāo)記基因去除方法中，共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)法運用最早，方法較為成熟，操作簡單，運用較為廣泛。位點特異性重組系統(tǒng)法因其定點刪除、重組頻率高等特點，展現(xiàn)出廣闊的運用前景。去除標(biāo)記基因技術(shù)仍在不斷完善和改進(jìn)當(dāng)中。選擇何種方法應(yīng)根據(jù)不同植物的特性以及各方法的優(yōu)缺點綜合考慮?，F(xiàn)代基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展為解決轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題帶來了新的解決思路，研究者可以嘗試運用多種系統(tǒng)方法聯(lián)合使用的形式來進(jìn)行研究。轉(zhuǎn)基因植物中，隨機插入可能會引起負(fù)面效應(yīng)，內(nèi)源基因突變及基因沉默是研究者需要關(guān)注以及有待解決的關(guān)鍵。當(dāng)今轉(zhuǎn)基因植物的食用安全問題和環(huán)境安全問題仍是該研究領(lǐng)域有待解決的瓶頸問題。要善于運用發(fā)散思維、勇于創(chuàng)新，以達(dá)到更為簡單、高效和安全性更好的轉(zhuǎn)基因植物中選擇性標(biāo)記基因去除方法的目標(biāo)，為實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物安全性的進(jìn)一步研究提供廣闊的平臺?？傊D(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的去除方法廣泛運用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生等行業(yè)大有潛能，我們也堅信用其方法能為人類健康事業(yè)謀福利。

［1］ James C. Global status of commercialized biotech/GM crops：2012［R］. International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications ISAAA， 2013.

［2］Kapusi E， Hensel G， Coronado MJ， et al. The elimination of a selectable marker gene in the doubled haploid progeny of cotransformed barley plants［J］. Plant Molecular Biology， 2013， 81（1-2）：149-160.

［3］郭敏亮， 諸慶， 高佃坤. 產(chǎn)生無標(biāo)記農(nóng)桿菌突變體方法的建立及優(yōu)化［J］. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2009（5）：556-565.

［4］單曉呋， 李蓓， 張舉仁. 利用FLP/frt重組系統(tǒng)產(chǎn)生無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因煙草植株［J］. 生物工程學(xué)報， 2006， 22（5）：744-750.

［5］王根平， 杜文明， 夏蘭琴. 植物安全轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究現(xiàn)狀與展望［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 47（5）：823-843.

［6］ Komari T， Hiei Y， Saito Y， et al. Vectors carrying two separate TDNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers［J］. Plant J， 1996， 10（1）：165-174.

［7］ Miller M， Tagliani L， Wang N， et al. High efficiency transgene segregation in co-transformed maize plants using an Agrobacterium tumefaciens 2 T-DNA binary system［J］. Transgenic Research，2002， 11（4）：381-396.

［8］Romano A， Raemakers K， Bernardi J， et al. Transgene organisation in potato after particle bombardment-mediated（co-）transformation using plasmids and gene cassettes［J］. Transgenic Research，2003， 12（4）：461-473.

［9］Shiva Prakash N， Bhojaraja R， Shivbachan SK， et al. Marker-free transgenic corn plant production through co-bombardment［J］. Plant Cell Reports， 2009， 28（11）：1655-1668.

［10］ Andrew PG， Cleofe N. Transposition mediated Re-positioning and subsequent elimination of marker genes from transgenic tomato［J］. Bio/Technology， 1993， 11（11）：1286-1292.

［11］ Yoder JI， Goldsbrough AP， et al. Transformation systems for generating marker-free transgenic plants［J］. Bio/Technology，1994， 12（3）：263-267.

［12］洪林， 閆曉紅， 劉正富， 等. A c/Ds系統(tǒng)及其在油菜突變體庫構(gòu)建中的應(yīng)用策略［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2012， 43（6）：738-743.

［13］Krishnaswamy L， Zhang JB， Peterson T. Fusion of reverse-oriented Ds termini following abortive transposition in Arabidopsis：implications for the mechanism of Ac/Ds transposition［J］. Plant Cell Reports， 2010， 29（4）：413-417.

［14］趙愛春， 龍定沛， 譚兵， 等. FLP/FRT位點特異性重組系統(tǒng)在高等真核生物中的研究進(jìn)展［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 44（15）：3252-3263.

［15］ Li B， Li N， Duan X， et al. Generation of marker-free transgenic maize with improved salt tolerance using the FLP/FRT recombination system［J］. J Biotechnol， 2010， 145（2）：206-213.

［16］Fladung M， Schenk TMH， Polak O， et al. Elimination of marker genes and targeted integration via FLP/FRT recombination system from yeast in hybrid aspen（Populus tremula L.×P. tremuloidesMichx. ）［J］. Tree Genetics and Genomes， 2010， 6（2）：205-217.

［17］Cregg JM， Madden KR. Use of site-specific recombination to regenerate selectable markers［J］. Molecular and General Genetics， 1989， 219（1-2）：320-323.

［18］Khan R， Nakamura I， Mii M. Development of disease-resistant marker-free tomato by R/RS site-specific recombination［J］. Plant Cell Reports， 2011， 30（6）：1041-1053.

［19］Saelim L， Phansiri S， Suksangpanomrung M， et al. Evaluation of a morphological marker selection and excision system to generate marker-free transgenic cassava plants［J］. Plant Cell Reports，2009， 28（3）：445-455.

［20］Sugita K， Matsunaga E， Ebinuma H. Effective selection system for generating marker-free transgenic plants independent of sexual crossing［J］. Plant Cell Reports， 1999， 18（11）：941-947.

［21］Hirano N， Muroi T， Takahashi H， et al. Site-specific recombinases as tools for heterologous gene integration［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2011， 92（2）：227-239.

［22］Zuo J， Niu QW， Moller SG， et al. Chemical-regulated， site-specific DNA excision in transgenic plants［J］. Nature Biotechnology，2001， 19（2）：157-161.

［23］ 楊平， 蔡小寧， 鐘小仙. 擬南芥AtNHX1基因克隆和cre（lox）植物表達(dá)載體構(gòu)建［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007（6）：356-358.

［24］郭霞， 李莉， 張毅， 等. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)Bt基因轉(zhuǎn)化水稻的研究［J］. 生物學(xué)雜志， 2009， 26（2）：21-23.

［25］Khattri A， Nandy S， Srivastava V， et al. Heat-inducible Cre-lox system for marker excision in transgenic rice［J］. J Biosci， 2011，36（1）：37-42.

［26］蘆春斌， 高忱. 重疊PCR合成HPV16 E6、E7基因并構(gòu)建植物表達(dá)雙元載體［J］. 生物技術(shù)通報， 2011（4）：143-146.

［27］尚玉花， 李莉， 陸徐忠， 等. 利用Cre/loxP系統(tǒng)刪除轉(zhuǎn)Bt基因水稻中的選擇標(biāo)記基因［J］. 生物學(xué)雜志， 2011， 28（2）：5-8.

［28］Chong-Perez B， Kosky RG， Reyes M， et al. Heat shock induced excision of selectable marker genes in transgenic banana bythe Crelox site-specific recombination system［J］. J Biotechnol， 2012，159（4）：265-273.

［29］Maeser S， Kahmann R. The Gin recombinase of phage Mu can catalyse site-specific recombination in plant protoplasts［J］. Mol Gen Genet， 1991， 230（1-2）：170-176.

［30］ 楊東生， 張研， 張建會， 等. Cre/Loxp重組酶系統(tǒng)與轉(zhuǎn)基因［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 38（8）：3916-3918.

［31］ Zou X， Peng A， Xu L， et al. Efficient auto-excision of a selectable marker gene from transgenic citrus by combining the Cre/loxP system and ipt selection［J］. Plant Cell Reports， 2013， 32（10）：1601-1613.

［32］ García-Almodóvar RC， Petri C， Gonzale-Padilla IMG， et al. Combination of site-specific recombination and a conditional selective marker gene allows for the production of marker-free tobacco plants［J］. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2014，116（2）：205-215.

［33］ Righetti L， Djennane S， Berthelot P， et al. Elimination of the nptII marker gene in transgenic apple and pear with a chemically inducible R/Rs recombinase［J］. Plant Cell， Tissue and Organ Culturce， 2014， 117（3）：335-348.

［34］ 鄒麗婷， 宋洪元. 噬菌體phiC31位點重組酶系統(tǒng)在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 42（5）：1298-1301.

［35］Ebinuma H， Nanto K， Kasahara S， et al. Marker-free gene targeting by recombinase-mediated cassette exchange［J］. Methods Mol Biol， 2012， 847：379-390.

［36］ Luo KM， Duan H， Zhao DG， et al. GM-gene-deletor：fused loxPFRT recognition sequences dramatically improve the efficiency of FLP or CRE recombinase on transgene excision from pollen and seed of tobacco plants［J］. Plant Biotechnol J， 2007， 5：263-374.

［37］ 鄒璐琳， 魏建華， 王宏芝， 等. 高效刪除標(biāo)記基因的Bhlea2植物表達(dá)載體的構(gòu)建［J］. 生物技術(shù)通報， 2011（11）：79-82.

［38］Nandy S， Srivastava V. Marker-free site-specific gene integration in rice based on the use of two recombination systems［J］. Plant Biotechnology Journal， 2012， 10（8）：904-912.

［39］晁岳恩， 吳政卿， 楊會民， 等. 11種植物psbA基因的密碼子偏好性及聚類分析［J］. 核農(nóng)學(xué)報， 2011， 25（5）：927-932.

［40］鞏智剛， 周海鵬， 徐芳， 等. 葉綠體轉(zhuǎn)化及其應(yīng)用于作物改良研究的最新進(jìn)展［J］. 核農(nóng)學(xué)報， 2012， 26（2）：288-294.

［41］Day A， Goldschmidt-Clermont M. The chloroplast transformation toolbox：selectable markers and marker remova［J］. Plant Biotechnology Journal， 2011， 9（5）：540-553.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Methods of Removing Marker Genes in Transgenic Plants

Lang Yaoling1，2Guan Xiaoyan1，2Bai Guohui2Liu Jianguo1，2
（1. School of Stomatology，Zunyi Medical University，Zunyi563000； 2. Special Key Laboratory of Oral Diseases Research，Institutions of Higher Education in Guizhou Province，Zunyi563000）

With more and more varieties of transgenic plants emerging， environmental and food safety from using transgenic plants have been attracting extensive public attentions. One of the current problems is that the selectable marker genes， usually having the antibiotic or herbicide resistance， remain in transgenic plants. In order to improve the safety of using transgenic plants， removing marker genes from transgenic plants is not only conducive to the multiple using the same transgenic plants， but also more likely to allow the transgenic plants accepted by people. The current methods of removing marker genes in transgenic plants were reviewed， and the advantages and disadvantages of each method were compared from all aspects， which have a guiding significance for selecting a proper method in this field.

transgenic plants；selectable marker genes；safety

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.007

2014-08-18

國家自然科學(xué)基金項目（81260164），貴州省第六批科技創(chuàng)新人才團隊建設(shè)項目（黔科合人才團隊［2013］4026號），貴州省高等學(xué)校重點學(xué)科建設(shè)項目（SZXK-201207-04），貴州省高等學(xué)校特色重點實驗室建設(shè)項目（黔教合KY字［2013］109號）

郎遙玲，女，碩士研究生，住院醫(yī)師，研究方向：齲病的免疫學(xué)防治；E-mail：296733308@qq.com

劉建國，男，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：齲病、牙周病病因和免疫學(xué)防治、氟斑牙發(fā)病機制、牙頜畸形矯治的基礎(chǔ)與臨床；E-mail：13087891001@163.com