李衛(wèi)強(qiáng)，朱西杰，蔡根深

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院，寧夏吳忠 751100)

基于Stat3通路復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑干預(yù)胃癌前病變大鼠的實(shí)驗(yàn)研究*

李衛(wèi)強(qiáng)1，2，朱西杰1，2，蔡根深1

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院，寧夏吳忠 751100)

目的:研究復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑對(duì)胃癌前病變(PLCC)Stat3通路蛋白表達(dá)的影響，從分子生物學(xué)水平揭示其干預(yù)PLCC的機(jī)制及其效果。方法:將120只SPF級(jí)SD雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、復(fù)方蜥蜴散80目治療組、100目治療組、80目100目等量混合治療組、胃癌前病變模型對(duì)照組、維酶素治療組，除空白對(duì)照組外，均以0.017 mol/L的MNNG溶液，按0.5 ml/100 g體質(zhì)量對(duì)大鼠灌胃，每日1次，連續(xù)24周，輔助采取2 d飽食、1 d饑餓的饑飽失常法，配合情緒刺激等制作PLCC大鼠模型。造模成功后，A組大鼠仍然充足供食及清潔蒸餾水，B組、C組、D組大鼠分別給予復(fù)方蜥蜴散80目、100目、80目100目等量混合糊劑混懸液10 ml/kg·d灌胃，每日1次;E組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液10 ml/kg·d灌胃，每日1次;F組大鼠給予0.1 g/ml維酶素混懸液10 ml/kg·d(1.0 g/kg·d)灌胃，每日1次，連續(xù)治療12周。觀察復(fù)方蜥蜴散對(duì)PLGC模型大鼠胃黏膜細(xì)胞Stat3、Bcl-2等抗凋亡蛋白的調(diào)控作用，探討該方對(duì)PLGC的干預(yù)機(jī)制。結(jié)果:通過(guò)Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化圖像的光密度進(jìn)行測(cè)算，結(jié)果表明治療前各組與空白對(duì)照組比較，Stat3、Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后各治療組與模型組比較，Stat3、Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中復(fù)方蜥蜴散各治療組與維酶素治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尤其以復(fù)方蜥蜴散80目100目等量混合治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而復(fù)方蜥蜴散各治療組間比較，80目治療組與100目治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與80目100目等量混合組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑對(duì)PLCC模型大鼠胃黏膜的增生腸化具有修復(fù)逆轉(zhuǎn)作用，且能降低Stat3、Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，Bcl-2蛋白的表達(dá)提高胃黏膜Bax蛋白表達(dá)，這可能是復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑干預(yù)PLCC的分子生物學(xué)機(jī)制。

Stat3通路;復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑;胃癌前病變;實(shí)驗(yàn)研究

萎縮性胃炎(chronic artrophic gastritis，CAG)伴中度以上腸化生(IM)或異型增生(ATP)被稱(chēng)為胃癌前病變(PLGC)。Correa提出腸型胃癌的發(fā)生模式為正常胃黏膜→淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→不典型增生→胃癌。胃黏膜上皮細(xì)胞異型增生(dysplasia，Dys)是胃癌形成過(guò)程中的一個(gè)重要發(fā)展階段，異型增生癌變率為 4.0% ～19.0%［1-2］。因此，逆轉(zhuǎn)胃癌前病變、減少胃癌的發(fā)生是目前研究的熱點(diǎn)。經(jīng)過(guò)多年研究我們發(fā)現(xiàn)，胃癌前病變證候類(lèi)型以虛實(shí)關(guān)聯(lián)證為主，陰液不足、黏膜失養(yǎng)、HP等濕熱疫毒侵襲、氣血運(yùn)行不暢、毒瘀交阻為主要病理，并結(jié)合多年寧夏密點(diǎn)麻蜥對(duì)胃黏膜修復(fù)的基礎(chǔ)及臨床研究，以益氣養(yǎng)陰、化瘀解毒為法，組成復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑(寧夏密點(diǎn)麻蜥、黃芪、烏梅、白芍、丹參、半枝蓮)治療胃癌前病變?nèi)〉昧溯^好的臨床療效。由于胃癌發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未完全清楚。因此，胃癌的二級(jí)預(yù)防，即逆轉(zhuǎn)PLGC就顯得尤為重要。本研究旨在復(fù)制胃癌前病變SD大鼠模型，并應(yīng)用免疫組化法觀察復(fù)方蜥蜴散對(duì)PLGC模型大鼠胃黏膜細(xì)胞Stat3、Bcl-2等抗凋亡蛋白的調(diào)控作用，探討該方對(duì)PLGC的干預(yù)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠120只，4～6周齡，體質(zhì)量150～180 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證編號(hào)SCXK(寧)2011-0001)。SPF大小鼠生長(zhǎng)繁殖飼料，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供(產(chǎn)品批號(hào)12083123)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

MNNG 5 g/瓶，東京化成工業(yè)株式會(huì)社(產(chǎn)品批號(hào)A45400A);維酶素0.2 g×100片/瓶，新鄉(xiāng)恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司(產(chǎn)品批號(hào)20120208);復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑，由寧夏密點(diǎn)麻蜥、黃芪、烏梅、白芍、丹參、半枝蓮等組成，過(guò)80目篩和100目篩的2種微粒組合而成，由寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供;0.9%氯化鈉溶液250 ml/瓶，吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)1208260408)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器

1.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗大鼠多克隆Stat3抗體(批號(hào)B4501);兔抗大鼠多克隆Bcl-2抗體(批號(hào)B7001)，美國(guó)Immunoway生物技術(shù)公司;PV-6001通用型二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(批號(hào)K133319E)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;ZLI-9018濃縮型DAB顯色試劑盒(批號(hào)K135222E)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;檸檬酸鹽緩沖液ZLI-9064 1000 ml/袋Citrate(0.01M PH 6.0)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;PBS磷酸鹽緩沖液ZLI-9062 2000 ml/袋 Citrate(0.01M PH 7.2-7.4)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3.2 主要儀器 石蠟切片機(jī)LEICA 2135，上海萊卡公司;超低溫冰箱BCD-201/HC，廣東科龍電器公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱GNP-9080型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;超凈工作臺(tái)YJ-1450型，蘇州凈化設(shè)備公司;PH計(jì)，TOLEDO，USA;高壓蒸汽消毒鍋，廣東Galanz公司;Galanz機(jī)械不銹鋼燒烤微波爐WD7505，珠海飛龍電器有限公司;微量移液器，EPPendorf，Germany;數(shù)顯恒溫水浴箱，北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9162，上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)儀器廠;漂烘片機(jī)YABO 200，常州市雅博電子設(shè)備有限公司;孵育盒(濕盒)，福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;病理組織包埋冷凍臺(tái)BMJ-Ⅲ型，常州中威電子儀器廠;圖像采集系統(tǒng)顯微鏡BH2-RFCA，日本OLYMPUS公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

120只SPF級(jí)SD雄性大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，即空白對(duì)照組、復(fù)方蜥蜴散80目治療組、100目治療組、80目100目等量混合治療組、胃癌前病變模型對(duì)照組、維酶素治療組，編為A-F組，每組20只，相同條件下分籠飼養(yǎng)，喂飼SPF大小鼠生長(zhǎng)繁殖飼料，自由飲水，室溫(20±2)℃，濕度55%～60%。

2.2 藥物配制

MNNG溶液按0.017 mol/L濃度配制，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＞S酶素混懸液將維酶素片研末，用生理鹽水配成0.1 g/ml的混懸液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑混懸液用復(fù)方蜥蜴散80目篩、100目篩、80目篩100目篩1∶1混合物經(jīng)過(guò)粉碎、高溫滅菌、蒸2.5 h，晾干后用雙蒸水分別配成配成0.14 g/ml糊劑混懸液裝瓶，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3 造模方法及治療措施

3.1 造模方法

參考大量文獻(xiàn)［3-7］造模。除空白對(duì)照組外，每天以0.017 mol/L的MNNG溶液，按0.5 ml/100 g體質(zhì)量對(duì)大鼠灌胃，每日1次，連續(xù)24周，輔助采取2 d飽食、1 d饑餓的饑飽失常法，飽食日自由飲食，饑餓日禁食不禁水，配合情緒刺激等，A組大鼠充足供應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及清潔蒸餾水。

3.2 治療措施

造模24周后，B-F組隨機(jī)選取1只大鼠處死，取胃黏膜做病檢，證明符合胃癌前病變的病理診斷。造模成功后，A組大鼠仍然充足供食及清潔蒸餾水，B-F組大鼠則停止造模，B組、C組、D組大鼠分別給予復(fù)方蜥蜴散80目、100目、80目100目等量混合糊劑混懸液10 ml/kg·d灌胃，每日1次;E組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液10 ml/kg·d灌胃，每日1次;F組大鼠給予0.1 g/ml維酶素混懸液10 ml/kg·d (1.0 g/kg·d)灌胃，每日1次，連續(xù)治療12周。

4 標(biāo)本采集與處理

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至預(yù)定階段(給藥4周、8周、12周后各治療組各處死3只大鼠)，大鼠禁食水24 h后，用10%水合氯醛溶液腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠。剖腹，距賁門(mén)和幽門(mén)1.5 cm離斷取出全胃。沿胃大彎側(cè)剖開(kāi)，冰生理鹽水沖洗后濾紙吸干鋪開(kāi)。胃黏膜標(biāo)本固定于10%的中性福爾馬林溶液中，胃體部取2 cm ×5 mm縱切條狀組織，固定24 h后梯度脫水，石蠟包埋備用。常規(guī)HE染色做病理組織學(xué)檢驗(yàn)，鄰近切片做免疫組化染色。

5 Stat3、Bcl-2免疫組化染色

將實(shí)驗(yàn)用切片置于60℃恒溫電烤箱中過(guò)夜(12～16 h)。切片脫蠟:將切片置于二甲苯溶液中透明15 min×2次。水化:切片轉(zhuǎn)移至100%酒精中浸泡1 min×2次，然后依次在95%、80%和75%酒精中各浸泡30 s。用PBS(pH7.4)沖洗3 min×3次，高壓法抗原熱修復(fù):枸櫞酸抗原修復(fù)液加熱沸騰后加入切片浸沒(méi)，加壓待持續(xù)噴氣之后定時(shí)2 min遠(yuǎn)離熱源，自來(lái)水沖洗至室溫。消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的影響:每張切片加入1滴(50 μL)3%H202，室溫或37℃孵育10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS沖洗3 min×3次。甩去PBS液，每張切片加1滴(50 μL)正常山羊非免疫性血清封閉，室溫或37℃孵育15 min。加“一抗”:甩去血清，每張切片加1滴(50 μL)新鮮配制的一抗，置于濕盒內(nèi)放入4℃冰箱孵育過(guò)夜。將濕盒從4℃冰箱中取出，放入37℃電熱恒溫箱中復(fù)溫45 min。PBS沖洗3 min ×3次。加二抗:甩去PBS液，每張切片加1滴(50 μL)二抗工作液，室溫或37℃孵育30 min。PBS沖洗3 min×3次。顯色:甩去PBS液，每張切片加2滴(100 μL)新鮮配制的DAB染色液，2～10 min后顯微鏡下觀察，有陽(yáng)性顯色即用自來(lái)水沖洗中止顯色，自來(lái)水沖洗3次。復(fù)染:切片置蘇木素常規(guī)反應(yīng)1 min，自來(lái)水沖洗3次。切片置鹽酸酒精分化數(shù)秒后自來(lái)水沖洗。脫水:切片依次置于80%、95%酒精中浸泡30 min×1次，最后100%酒精中浸泡4 min×2次，取出晾干;切片二甲苯透明5 min×2次后晾干，中性樹(shù)膠封片。

用已知的陽(yáng)性切片做陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照片由試劑公司提供，用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果由2名病理醫(yī)師判定。判定標(biāo)準(zhǔn):無(wú)著色的為陰性(－)，較背景著色略深的為弱陽(yáng)性(+)，明顯加深的則為強(qiáng)陽(yáng)性(＞++)。Stat3抗體使用濃度1∶150，Bcl-2抗體使用濃度1∶150。

6 統(tǒng)計(jì)分析

6.1 圖像采集分析方法

采用數(shù)碼顯微鏡捕捉免疫組化圖片(jpg格式):采用Image－Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野測(cè)定陽(yáng)性區(qū)域圖像的平均光密度(AOD)。圖像分割與自動(dòng)計(jì)算:選定分割范圍后，點(diǎn)擊“分割”按鈕選擇手動(dòng)分割。根據(jù)IHC陽(yáng)性染色區(qū)域的不同，通過(guò)RGB顏色直方圖來(lái)調(diào)節(jié)分割的范圍及閾值。點(diǎn)擊“自動(dòng)計(jì)算”，對(duì)已分割好的圖像自動(dòng)測(cè)定陽(yáng)性區(qū)域的光學(xué)密度值。

6.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料呈正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，數(shù)據(jù)運(yùn)用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，組間比較經(jīng)方差其同性檢驗(yàn)后采用成組t檢驗(yàn);多組間比較當(dāng)各組方差齊時(shí)用LSD法進(jìn)行均數(shù)間的兩兩比較，當(dāng)各組方差不齊時(shí)用Dunnett法進(jìn)行均數(shù)間的兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

7 結(jié)果

7.1 胃黏膜病理組織學(xué)結(jié)果

圖1顯示，空白對(duì)照組大鼠胃黏膜上皮完整，腺體排列密集，大小形狀較一致，胞漿透明或呈小空泡狀，腺上皮和腺管分界清楚，黏膜肌層較薄，可見(jiàn)少量散在淋巴細(xì)胞。

圖2顯示，造模后，治療前胃黏膜明顯變薄，腺體明顯減少，腸化生的杯狀細(xì)胞明顯增多;腺管密集，大小形狀、排列甚不規(guī)則、紊亂，甚至背靠背出現(xiàn)共壁現(xiàn)象;核增大變橢圓，染色質(zhì)增多，核漿比值增大。

圖3顯示，復(fù)方蜥蜴散80目治療組胃黏膜完整清晰，呈慢性炎癥，固有層可見(jiàn)淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下肌層增厚，可見(jiàn)血管增生。

圖4顯示，復(fù)方蜥蜴散100目治療組:胃黏膜完整，腺體排列較整齊，黏膜淺層有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖5顯示，復(fù)方蜥蜴散80目100目等量混合治療組胃黏膜結(jié)構(gòu)較清晰，胃黏膜上皮排列規(guī)整，細(xì)胞大小形態(tài)也較一致，腺上皮和腺管分界清楚，胃體部無(wú)明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖6顯示，胃癌前病變模型治療組胃黏膜組織明顯變薄，腺體減少，黏膜腺體萎縮，腺腔增大，固有層有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜肌層增厚，纖維增生明顯;基底部腺體上皮增生，核深染，部分腺體結(jié)構(gòu)不規(guī)則，有的出現(xiàn)共壁現(xiàn)象。

圖7顯示，維酶素治療組胃黏膜可見(jiàn)部分黏膜上皮有輕、中度腸化或輕、中度不典型增生。部分腺體結(jié)構(gòu)較紊亂，大小形狀欠規(guī)則、密集、分支狀;核增大、深染、排列較亂、參差不齊，可見(jiàn)核分裂象。

7.1 胃黏膜病理組織學(xué)結(jié)果

圖1 空白對(duì)照組(400×)

圖2 造模后與治療前(400×)

圖3 80目治療組 (400×)

圖4 100目治療組(400×)

圖5 80目100目等量混合治療組 (400×)

圖6 模型對(duì)照組(400×)

圖7 維酶素治療組(400×)

7.2 Stat3、Bcl-2免疫組化染色結(jié)果

圖8顯示，Stat3蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要在細(xì)胞漿中，部分可見(jiàn)于細(xì)胞核，陽(yáng)性部位著棕黃色顆粒，顏色濃淡不一，不均勻性地分布于細(xì)胞漿部位。Bcl-2主要定位在核膜的胞質(zhì)面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體的外膜上，呈淡黃色或棕黃色細(xì)顆粒狀?？瞻讓?duì)照組黏膜細(xì)胞可見(jiàn)少量棕黃色染色(以Stat3為例)。在治療前，各造模組均呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，黏膜細(xì)胞可見(jiàn)大量棕黃色染色，著色均勻清晰。復(fù)方蜥蜴散80目治療組、100目治療組、80目100目等量混合治療組陽(yáng)性表達(dá)明顯減少且接近正常，黏膜細(xì)胞可見(jiàn)少量散在棕黃色細(xì)顆粒狀染色;胃癌前病變模型對(duì)照組與治療前相當(dāng)，仍然可見(jiàn)黏膜細(xì)胞大量棕黃色染色;維酶素治療組可見(jiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)，黏膜細(xì)胞呈棕黃色染色;陰性對(duì)照則無(wú)陽(yáng)性著色。

7.3 Stat3、Bcl-2免疫組化染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表1、2顯示，通過(guò)Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化圖像的光密度進(jìn)行測(cè)算，結(jié)果表明治療前各組與空白對(duì)照組比較，Stat3、Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療后，各治療組與模型組比較，Stat3、Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，其中復(fù)方蜥蜴散各治療組與維酶素治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明復(fù)方蜥蜴散對(duì)胃癌前病變的治療作用優(yōu)于維酶素，尤其以復(fù)方蜥蜴散80目100目等量混合治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明復(fù)方蜥蜴散80目100目等量混合治療組降低Stat3、Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)，治療并修復(fù)胃癌前病變黏膜的作用最強(qiáng)。而復(fù)方蜥蜴散各治療組組間比較，80目治療組與100目治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而與80目100目等量混合組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明復(fù)方蜥蜴散80目100目等量混合對(duì)胃癌前病變治療效果優(yōu)于單純用80目或者100目。

表1 治療后各組大鼠胃黏膜Stat3表達(dá)(±s)

表1 治療后各組大鼠胃黏膜Stat3表達(dá)(±s)

組別鼠數(shù) AOD值空 白 對(duì) 照 組 (A)8 0.210905±0.011409復(fù) 方 蜥 蜴 散 8 0目 治 療 組 (B) 8 0.235476±0.013161＊▲復(fù) 方 蜥 蜴 散 1 0 0目 治 療 組 (C) 8 0.235520±0.009821＊▲復(fù)方蜥蜴散80目100目等量混合治療組(D) 8 0.215870±0.009015▼▲＊胃 癌 前 病 變 模 型 治 療 組 (E) 8 0.304699±0.024705*維 酶 素 治 療 組 (F) 8 0.255190±0.017730＊▲

表2 治療后各組大鼠胃黏膜Bcl-2表達(dá)(±s)

表2 治療后各組大鼠胃黏膜Bcl-2表達(dá)(±s)

注:各治療組與A組比較:*P＜0.01，▼P＞0.05;與B或C組比較:▲P＜0.05，*P＜0.01;與F組比較:▲P＜0.05，*P＜0.01

組別鼠數(shù) AOD值空 白 對(duì) 照 組 (A)8 0.239695±0.027230復(fù) 方 蜥 蜴 散 8 0目 治 療 組 (B) 8 0.262580±0.019138＊▲復(fù) 方 蜥 蜴 散 1 0 0目 治 療 組 (C) 8 0.262672±0.013638＊▲復(fù)方蜥蜴散80目100目等量混合治療組(D) 8 0.240452±0.006501▼▲＊胃 癌 前 病 變 模 型 治 療 組 (E) 8 0.361186±0.012544*維 酶 素 治 療 組 (F) 8 0.284292±0.022041＊▲

4 討論

胃癌前病變(PLGC)屬于中醫(yī)學(xué)“胃痛”、“胃痞”等范疇，反復(fù)發(fā)作的胃脘部疼痛、脹滿(mǎn)不適常給患者帶來(lái)較大痛苦，但其癌變趨勢(shì)卻更引起患者心理焦慮。我們研究發(fā)現(xiàn)，寧夏為胃癌的高發(fā)區(qū)，尤以回族群眾顯著，可能與氣候較為寒冷、過(guò)食燒烤及辛辣刺激性食物有關(guān)。因此，PLCC的防治對(duì)于阻斷胃癌病勢(shì)發(fā)展尤為重要。我們研究發(fā)現(xiàn)，本病雖病位在胃，但與脾關(guān)系最為密切。患者常因飲食、情緒及濕熱毒邪HP感染等因素引起脾胃虛弱、毒熱內(nèi)稽、氣血生化不足、運(yùn)行乏力、陰血虧虛、胃黏膜失養(yǎng)、黏膜下微循環(huán)障礙，久則血絡(luò)瘀滯而見(jiàn)黏膜腸化、增生，形成胃癌前病變，故毒瘀交阻是胃癌前病變的主要病機(jī)，據(jù)此創(chuàng)立復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑。

信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(Stats)是一種存在于胞漿內(nèi)的蛋白家族，在激活后能夠轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合，具有信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控雙重功能。在Stat家族成員中，Stat3在人類(lèi)癌癥中最常見(jiàn)［8］，廣泛存在于正常細(xì)胞和組織中，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增生、惡性變以及凋亡等機(jī)制;介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)和維持線(xiàn)粒體正常功能，其過(guò)度激活可誘發(fā)腫瘤。Stat3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到的作用是樞紐式的，通常是通過(guò)Stat3靶基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)、血管發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及免疫逃避。激活的Stat3可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而實(shí)現(xiàn)這些功能需要通過(guò)調(diào)節(jié)其下游的抗凋亡和增殖相關(guān)蛋白，如Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、Fas、Cyclin D1、Survivin和 c-Myc［8-13］。激活的Stat3誘導(dǎo)核因子κB P100至P53，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡［14］，而細(xì)胞的增殖和凋亡類(lèi)似于中醫(yī)的陰陽(yáng)。正如《金匱要略》中所言:“厥陽(yáng)獨(dú)行”是疾病發(fā)生的主要病機(jī)，即陰陽(yáng)失衡則雜病而生。因此，調(diào)整陰陽(yáng)也是中醫(yī)治療疾病的主要方法，具體可以體現(xiàn)在調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡方面。

B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)基因是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制基因，是迄今研究最深入、最廣泛的凋亡調(diào)控基因之一?，F(xiàn)已證明，Bcl-2是最重要的抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的基因，其表達(dá)產(chǎn)物Bcl-2蛋白具有抗凋亡的作用。

本實(shí)驗(yàn)研表明，在各組中尤以復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑組效果明顯，可以有效降低PLCC模型大鼠胃黏膜高表達(dá)的Stat3、Bcl-2蛋白水平，促進(jìn)萎縮、增生腸化的胃黏膜修復(fù)，具有較好的干預(yù)胃癌前病變進(jìn)程和預(yù)防癌變的作用。

此外，PLCC是一個(gè)慢性的發(fā)病及治療過(guò)程，療程多在3個(gè)月以上。我們研究還發(fā)現(xiàn)，中藥湯劑長(zhǎng)期使用往往會(huì)由于腸道的適應(yīng)性而致療效下降。正如《臨證指南醫(yī)案》曰:“慢性疾患，以湯劑蕩滌，速而不達(dá)，乃胃氣不受藥之故”，“積滯宜溫下者，以散劑徐攻，免傷胃氣”，“丸劑、膏劑緩圖，以保胃氣”。另外臨床及實(shí)驗(yàn)研究也表明，藥物顆粒的大小與療效有關(guān)。我們觀察了不同大小顆粒藥物的作用，發(fā)現(xiàn)過(guò)80和100目篩的顆?；旌媳葐斡眠^(guò)80、100目篩顆?；蚱渌w?；旌席熜Ц茫驒C(jī)體對(duì)不同顆粒大小的藥物分解吸收時(shí)間不同，因而呈現(xiàn)出一定的緩釋效應(yīng)，延長(zhǎng)了藥物的作用時(shí)間，提高了療效。該方中寧夏密點(diǎn)麻蜥解毒散結(jié)、活血通絡(luò);半枝蓮清熱解毒、利濕殺“蟲(chóng)”;烏梅、白芍養(yǎng)陰柔肝止痛、健胃生酸助運(yùn)化;丹參養(yǎng)血活血、化瘀通絡(luò);黃芪益氣養(yǎng)血，氣足則血生。諸藥合用，發(fā)揮制酸、斂瘡、生肌、止痛之效，則氣陰生化有源、黏膜得養(yǎng)、毒瘀得散、腸化增生得消，促進(jìn)黏膜修復(fù)值得深入研究。

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R573.3+2

B

1006-3250(2015)06-0656-04

2015-03-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160482);寧夏自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NZ11102);寧夏高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目(NGY2013067)

李衛(wèi)強(qiáng)，副教授，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)藥治療脾胃病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。