金永玲，楊蘇寧，叢 斌，王麗艷

(1．沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，遼寧 沈陽110161;2．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶163319)

黑龍江省草原面積較大，多分布于西部松嫩平原的大慶、杜蒙、肇源及肇州等地區(qū)，蝗蟲發(fā)生種類較多，危害嚴重［1］。近幾年，由于北方降水量下降，氣候干旱，冬季氣溫偏高等氣象因素的影響，蝗蟲的發(fā)生率逐年上升，蟲口密度最高達到300 ～500 頭·m－2，甚至更高，嚴重影響農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展［2］。草原蝗蟲綜合治理中，化學(xué)防治仍是主要的治理手段。但是，隨著殺蟲劑的廣泛應(yīng)用，害蟲抗藥性問題越來越突出。解毒酶活性提高是導(dǎo)致昆蟲抗藥性產(chǎn)生最直接的生化表現(xiàn)。參與昆蟲體內(nèi)殺蟲劑代謝的解毒酶主要包括羧酸酯酶，細胞色素P450 單加氧酶和谷胱甘肽S －轉(zhuǎn)移酶［3］。近年來，隨著分子生物學(xué)以及昆蟲基因組學(xué)的發(fā)展，昆蟲抗藥性分子機理有了突破性進展，與抗藥性相關(guān)的細胞色素單加氧酶、羧酸酯酶以及谷胱甘肽S －轉(zhuǎn)移酶3 個解毒酶家族基因也得到廣泛驗證［4-6］。已有研究針對蝗蟲，分析了東亞飛蝗(Locusta migratoria manilensis)和中華稻蝗(Oxya chinensis)體內(nèi)解毒酶的變化與有機磷農(nóng)藥和菊酯類農(nóng)藥抗性的關(guān)系［7-10］，其他種類蝗蟲抗藥性的研究還未見報道。

黃脛小車蝗(Oedaleus infernalis)屬直翅目、蝗總科昆蟲，是我國北方地區(qū)草原及農(nóng)牧交錯地帶的優(yōu)勢種蝗蟲，危害嚴重［11］。目前，對黃脛小車蝗的生物學(xué)特性、發(fā)生分布與植被的關(guān)系、遺傳多樣性、危害與防治等［12-20］方面進行了大量的研究。雖然關(guān)于黃脛小車蝗等土蝗對常用殺蟲劑會產(chǎn)生抗性已有報道［19］，譬如氰戊菊酯(Fenvalerate)是治理蝗蟲的擬除蟲菊酯類殺蟲劑之一［21］，通過觸殺和胃毒維持長效防治效果［22］，但其對黃脛小車蝗體內(nèi)解毒酶的影響尚不清晰。因此，研究氰戊菊酯作用對黃脛小車蝗解毒酶抗性產(chǎn)生的影響，有助于揭示氰戊菊酯治理黃脛小車蝗的機制。為此，本研究以黃脛小車蝗為研究對象，利用氰戊菊酯誘導(dǎo)室內(nèi)蟲源和田間蟲源，分析黃脛小車蝗體內(nèi)代謝解毒酶的變化情況，以確定參與氰戊菊酯抗性形成的解毒酶種類。

1 材料與方法

1．1 供試蝗蟲

室內(nèi)蟲源:黃脛小車蝗于2009 年采集于黑龍江省大慶市紅崗地區(qū)的天然草甸草原。采集回室內(nèi)后，在養(yǎng)蟲室內(nèi)籠罩飼養(yǎng)［溫度(26 ±2)℃，RH 為75%，光周期L∶ D = 14∶ 10］，每日飼喂新鮮麥苗繼代飼養(yǎng)，不接觸任何農(nóng)藥。選擇5 齡若蟲作為試驗材料。

田間蟲源:采集于黑龍江省大慶市紅崗(HG)、肇源(ZY)和林甸(LD)地區(qū)草原(均為草甸草原)，標(biāo)記為田間蟲源HG、田間蟲源ZY 和 田間蟲源LD。采回室內(nèi)后用小麥(Triticum aestivum)嫩葉飼養(yǎng)至5齡若蟲待用。

1．2 試驗藥品

90%氰戊菊酯原藥:山東華陽農(nóng)藥化工集團有限公司生產(chǎn)。

1．3 試驗方法

1．3．1 毒力測定 參考慕衛(wèi)等［23］的方法，采用點滴法測定氰戊菊酯對黃脛小車蝗5 齡若蟲的毒力。以丙酮為溶劑，將氰戊菊酯稀釋為6 個濃度。用微量注射器吸取2．5 μL 配制好的藥劑點滴在5 齡若蟲腹部，每一濃度處理點滴20 頭若蟲，雌雄各半。每個處理設(shè)置3 次重復(fù)，共60 頭若蟲。以點滴純丙酮作為對照。藥劑處理后，正常室溫條件下飼養(yǎng)，24 h 檢查死蟲數(shù)。以毛筆輕觸蟲體，不動為死亡。對照自然死亡率在5%內(nèi)為有效試驗。

抗性比=抗性種群LD50/敏感種群LD50。

1．3．2 酶抑制劑對氰戊菊酯的增效作用測定 參考李春生等［24］的方法，將3 種酶抑制劑增效醚(PBO)、磷酸三苯酯(TPP)和順丁烯二酸二乙酯(DEM)用丙酮稀釋一定的濃度(10 g·L－1)后，用微量注射器點滴2 μL 在5 齡黃脛小車蝗若蟲腹部(20 μg·頭－1)，酶抑制劑作用1 h 再用微量注射器點滴殺蟲劑，操作方法參見1．3．1。將測定結(jié)果與不使用增效劑的測定結(jié)果相比較，計算增效比。

1．3．3 解毒酶活性測定

對照組:分別選取室內(nèi)蟲源和田間蟲源ZY 的5齡若蟲制備酶液。

藥劑誘導(dǎo)組:首先利用氰戊菊酯亞致死劑量(LD10=3．72 ×10－3μg·頭－1)分別處理室內(nèi)蟲源和田間蟲源ZY 的5 齡若蟲(方法同1．3．1)，24 h 后取活蟲制備酶液。酶活性測定方法如下:

1)酯酶活性測定

取蝗蟲雌雄各一頭放入玻璃勻漿器，加1 mL 勻漿緩沖液(0．1 mol·L－1、pH 7．5、含0．3% Triton X-100 的磷酸緩沖液)勻漿，將勻漿液(15 000 g，4 ℃)離心20 min 后取上清液作為酶源備用。酯酶活性的測定參考van Asperen［25］的方法，加以修改。以α-NA 為底物測定酯酶活性，加入0．3 mmol·L－1α-NA 底物溶液，0．15 mL 待測酶液，0．75 mL 0．1 mol·L－1、pH 7．5、0．3% Triton X-10 的磷酸緩沖液，在37 ℃條件下，溫浴30 min，然后加入0．5 mL 固藍BSDS 溶液終止反應(yīng)，立即在600 nm 波長下測OD值。根據(jù)制作的標(biāo)準曲線和酶源蛋白含量，計算酶比活力。

2)谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶活性測定

取蝗蟲雌雄各1 頭放入玻璃勻漿器，加入1 mL勻漿緩沖液(0．1 mol·L－1、pH 7．5、含0．3% Triton X-100 的磷酸緩沖液)勻漿，將勻漿液(15 000 g，4℃)離心20 min 后取上清液作為酶源備用。以CDNB 為反應(yīng)底物測定谷胱甘肽S －轉(zhuǎn)移酶活性，參考Oppnoorth 等［26］的方法，根據(jù)試驗情況加以修改。取100 μL 稀釋的酶液加入2． 65 mL 磷酸緩沖液(0．1 mol·L－1pH 7． 5)和150 μL 20 mol·L－1GSH，然后放在25 ℃水浴鍋中溫浴5 min;加入100 μL 30 mmol·L－1CDNB，在25 ℃，340 nm 下立刻測試5 min 內(nèi)吸光值的變化(每隔20 s 測一次)。記錄反應(yīng)速度(OD340·min－1)，以每分鐘催化生產(chǎn)1 nmol 產(chǎn)物為1 個活性單位，酶活力公式為:GSTS(nmol·min－1)= (△OD340·V)/(ε·L)，式中，△OD340為每分鐘光吸收的變化值;V 為酶促反應(yīng)體積;ε 為消光系數(shù):0．009 6 L·μmol－1·cm－1;L 為比色杯光程(cm)。

3)多功能氧化酶O－脫甲基活性測定

多功能氧化酶O －脫甲基活性測定，參照Hansen 和Hodgson［27］的方法。取蝗蟲雌雄各一頭放入玻璃勻漿器，加入1 mL 勻漿緩沖液(0．1 mol·L－1、pH 7．5 磷酸緩沖液，含1 mmol·L－1的EDTA、DTT、PTU、PMSF 和20%的甘油)進行勻漿，將勻漿液(10 000 g，4 ℃)離心15 min 后取上清液作為酶源備用。取0．7 mL 酶液加入試管中，再依次加入1 mL 3．0 mmol·L－1的對硝基苯甲醚，在37 ℃下水浴5 min，再加入0．3 mL 20 mmol·L－1的還原型NADPH，迅速在405 nm 下測定20 min 內(nèi)的吸光值變化(每20 s 記錄一次)。以反應(yīng)速度表示酶活力OD405·min－1。

1．4 蛋白含量測定

酶原蛋白質(zhì)含量測定，采用Bradford［28］的考馬斯亮藍G-250 染色法。

1．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用SPSS13．0 數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計算毒力回歸式及LD10、LD50值;解毒酶活性用Duncan 氏新復(fù)極差法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2．1 氰戊菊酯對黃脛小車蝗的毒力測定

毒力回歸方程是經(jīng)過多次重復(fù)測定求出的，r值均大于0．98，求出的LD50值可信(表1)。對于室內(nèi)蟲源，LD50為4．38 ×10－3μg·頭－1。田間蟲源HG、LD 和ZY 的LD50分別為7．30 ×10－3、7．21 ×10－3和2．298 ×10－2μg·頭－1。田間蟲源HG、LD和ZY 對氰戊菊酯的抗性比分別為室內(nèi)蟲源的1．67、1．65 和5．25 倍。表明紅崗地區(qū)和林甸地區(qū)蝗蟲對氰戊菊酯較敏感，毒力相對較大，而肇源地區(qū)蝗蟲對氰戊菊酯的敏感性則下降，已經(jīng)到達了低抗水平。

2．2 3種酶抑制劑對氰戊菊酯的增效作用

PBO 對室內(nèi)蟲源、田間蟲源ZY 的增效比分別為2．16、3．91 倍，TPP 對室內(nèi)蟲源、田間蟲源ZY的增效比分別為2．00 和2．15倍。DEM 對室內(nèi)蟲源、田間蟲源ZY 的增效比分別是0．97 和1．04倍(表2)。說明增效醚和磷酸三苯酯對氰戊菊酯有增效作用，且對田間蟲源ZY 的增效作用好于室內(nèi)蟲源;而順丁烯二酸二乙酯則沒有表現(xiàn)出明顯的增效作用。

表1 氰戊菊酯對黃脛小車蝗毒力測定結(jié)果Table 1 Toxicity determination of fenvalerate on Oedaleus infernalis

表2 3 種酶抑制劑對氰戊菊酯增效作用Table 2 The synergism of three enzyme inhibitors to fenvalerate

2．3 氰戊菊酯亞致死劑量誘導(dǎo)對蝗蟲解毒酶比活力影響

未經(jīng)氰戊菊酯誘導(dǎo)的對照組，田間蟲源ZY 體內(nèi)酯酶活性顯著高于室內(nèi)蟲源(P ＜0．05)(表3)。經(jīng)過氰戊菊酯LD10誘導(dǎo)后，室內(nèi)蟲源和田間蟲源ZY酯酶活力均極顯著上升，室內(nèi)蟲源上升比值為2．25，田間蟲源ZY 上升比值為1．59。說明田間蟲源ZY 對氰戊菊酯敏感性下降可能與酯酶活性增加有關(guān)。同時，也說明氰戊菊酯亞致死劑量能夠顯著激活蝗蟲體內(nèi)酯酶的活力。

無論是對照組還是氰戊菊酯誘導(dǎo)組，田間蟲源ZY 和室內(nèi)蟲源黃脛小車蝗體內(nèi)谷胱甘肽S －轉(zhuǎn)移酶活性均在11．244 5 ～12．370 8 nmol·min－1·mg－1范圍內(nèi)，彼此間無顯著差異(P ＞0．05)(表3)。說明黃脛小車蝗經(jīng)氰戊菊酯誘導(dǎo)沒有顯著激活谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶的活性。

田間蟲源ZY 體內(nèi)多功能氧化酶O －脫甲基活性均顯著高于室內(nèi)蟲源(P ＜0．05)(表3)。經(jīng)過氰戊菊酯LD10誘導(dǎo)后，室內(nèi)蟲源和田間蟲源ZY 體內(nèi)多功能氧化酶活性均顯著升高，增加比值分別是1．21和1．45。說明多功能氧化酶O －脫甲基被氰戊菊酯激活，推斷田間蟲源ZY 對氰戊菊酯敏感性下降與該酶有關(guān)聯(lián)。

3 討論與結(jié)論

3．1 3 種酶抑制劑對氰戊菊酯的增效作用

本研究測定的室內(nèi)蟲源經(jīng)過室內(nèi)5 代以上連續(xù)飼養(yǎng)，對殺蟲劑的敏感性較高，擬定為相對敏感蟲源，與田間采集蟲源進行毒力比較，發(fā)現(xiàn)采集于黑龍江大慶肇源田間蟲源對氰戊菊酯敏感性顯著下降(P ＜0．05)，已經(jīng)表現(xiàn)出低水平的抗性。利用酶抑制劑進行體外增效作用的結(jié)果說明，TPP、PBO 作用于室內(nèi)蟲源和田間蟲源對氰戊菊酯都表現(xiàn)出增效作用，由于酶抑制劑對解毒酶系有特異性的抑制作用，可以作為殺蟲劑抗性機制的診斷工具，所以可以判斷黃脛小車蝗氰戊菊酯抗性形成與酯酶、多功能氧化酶有關(guān)聯(lián)。

當(dāng)前已有大量不同類型增效劑用于昆蟲的防治和抗性治理研究中。以甜菜夜蛾為研究對象，研究表明，PBO、TPP 和增效磷(SV1)對氰戊菊酯和順式氯氰菊酯均表現(xiàn)出明顯的增效作用［29］;PBO 對高效氯氰菊酯增效作用顯著，TPP 增效作用較差［24］;PBO、TPP 和DEF 對氯氰菊酯均表現(xiàn)出了增效作用，其中PBO 增效最高［30］。以棉鈴蟲為研究對象發(fā)現(xiàn)，PBO 對氰戊菊酯增效倍數(shù)最高［31-32］。曾鑫年和趙善歡［33］研究柑橘潛葉蛾氰戊菊酯抗性發(fā)現(xiàn)，PBO對氰戊菊酯的增效指數(shù)達2 430．3 倍，表明多功能氧化酶是柑桔潛葉蛾對氰戊菊酯抗藥性產(chǎn)生的主要機制。以上這些研究結(jié)果與本研究的結(jié)果相同，PBO 對菊酯類殺蟲劑均有很好的增效作用。說明多功能氧化酶可能是菊酯類殺蟲劑抗性形成的機制。同時，也說明針對昆蟲種類不同，藥劑品種不同，各種增效劑表現(xiàn)出的增效作用也各有不同。為確定解毒酶與抗性的關(guān)系，還需要進一步驗證。

表3 不同處理黃脛小車蝗解毒酶比活力比較Table 3 Comparison of the specific detoxifying enzymes activity of Oedaleus infernalis by different treatments

3．2 解毒酶活性比較

昆蟲體內(nèi)解毒酶活性變化是判斷昆蟲抗性產(chǎn)生的直接依據(jù)。解毒酶活性測定表明，田間蟲源的酯酶和多功能氧化酶活性均顯著高于室內(nèi)蟲源(P ＜0．05)。與毒力測定和增效劑測定結(jié)果相統(tǒng)一，均表明黃脛小車蝗對氰戊菊酯的敏感性下降。經(jīng)過氰戊菊酯亞致死劑量誘導(dǎo)，田間蟲源和室內(nèi)蟲源蟲體內(nèi)的酯酶和多功能氧化酶活性均明顯上升;而蟲體內(nèi)谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶活性變化不顯著。說明黃脛小車蝗對氰戊菊酯抗性形成與多功能氧化酶、酯酶有一定的聯(lián)系。蘭亦全和趙士熙［29］研究表明，羧酸酯酶活性的提高是甜菜夜蛾對氰戊菊酯和順式氯氰菊酯產(chǎn)生抗性的重要原因，谷胱甘肽S －轉(zhuǎn)移酶與兩種藥劑的抗性無關(guān)。金濤等［34］測定了9 個地理品系和相對敏感品系的桔小實蠅成蟲3 種解毒酶活性與抗性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)解毒酶活性增強，抗性水平高，且表現(xiàn)出MFO － O － 脫甲基活性、GST 活性和CarE 活性對高效氯氰菊酯抗性水平均起到正向作用;劉永杰和沈晉良［35］發(fā)現(xiàn)甜菜夜蛾抗性品系中腸微粒體甲氧試鹵靈O－脫甲基酶的活性比敏感品系的酶活性提高1．33 倍，說明甜菜夜蛾對氯氟氰菊酯的抗藥性與微粒體多功能氧化酶活性的提高密切相關(guān)。褐飛虱對噻嗪酮的抗性變化中，抗性品系的羧酸酯酶比活力增加到4．2 倍，說明其抗性形成可能與羧酸酯酶有關(guān)［35］。Rauch 和Nanen［36］報道，在煙粉虱中多功能氧化酶活性提高2 ～3 倍，但是抗性已經(jīng)達到了30 倍，說明多功能氧化酶活性提高只是抗性產(chǎn)生的原因之一。根據(jù)以上分析，結(jié)合本研究結(jié)果說明，針對不同昆蟲和不同殺蟲劑，抗藥性產(chǎn)生的原因是比較復(fù)雜的，酯酶和多功能氧化酶只是黃脛小車蝗對氰戊菊酯抗性產(chǎn)生的原因之一，關(guān)于其抗性機理還需要進一步的研究。

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