黃達(dá)，李鳴鏑，鄭亞琳，王秋虹，林蘭

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京100053)

下肢缺血再灌注對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)的影響?

黃達(dá)，李鳴鏑，鄭亞琳，王秋虹，林蘭△

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京100053)

目的:觀察下肢缺血再灌注對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)的影響。方法:24只清潔級(jí)SD雄性大鼠分為正常組(n=6)和糖尿病組(n=18)，糖尿病組采用鏈脲佐菌素造模。飼養(yǎng)1個(gè)月后，選擇部分糖尿病大鼠(n=9)作為缺血再灌注組，暫時(shí)阻斷腹主動(dòng)脈、髂總動(dòng)脈和股動(dòng)脈3個(gè)h，再灌注7 d后測(cè)量各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和動(dòng)作電位波幅，光鏡、電鏡下觀察坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:糖尿病缺血再灌注大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和動(dòng)作電位波幅均明顯下降，并出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)膜水腫、神經(jīng)纖維密度下降、異常神經(jīng)纖維數(shù)目增多、髓鞘腫脹、裂解、軸索萎縮等變化。結(jié)論:下肢缺血再灌注可以造成糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)嚴(yán)重?fù)p傷，采用此方法可以在短期內(nèi)建立糖尿病周圍神經(jīng)病變動(dòng)物模型。

糖尿病周圍神經(jīng)病變;缺血再灌注;神經(jīng)傳導(dǎo)速度;形態(tài)學(xué)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，也是目前的研究熱點(diǎn)，其動(dòng)物模型多從糖尿病動(dòng)物中獲得，隨著成模時(shí)間的延長(zhǎng)可逐漸觀察到神經(jīng)纖維功能和形態(tài)學(xué)變化［1-3］。國(guó)外報(bào)道糖尿病大鼠模型早期的生化和電生理改變與人類DPN相似，而周圍神經(jīng)病理形態(tài)學(xué)變化則較輕微［4］。在DPN新藥研發(fā)過(guò)程中，考慮到實(shí)驗(yàn)周期以及動(dòng)物死亡率等因素，多數(shù)實(shí)驗(yàn)在糖尿病模型建立后即開始給藥，此時(shí)周圍神經(jīng)病變尚未形成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能確切反映藥物的治療作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)暫時(shí)阻斷右側(cè)坐骨神經(jīng)的血液供應(yīng)，以了解下肢缺血再灌注對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)的損傷情況，并在此基礎(chǔ)上探討短期內(nèi)建立DPN動(dòng)物模型的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級(jí)SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量290～310 g (北京華阜康生物科技股份有限公司);鏈脲佐菌素(Sigma公司);BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技股份有限公司);DM-3000生物顯微鏡(Leica公司);EM UC7超薄切片機(jī)(Leica公司);JEM-1400透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)。

1.2 動(dòng)物模型制備

1.2.1 糖尿病模型制備適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，從24只SD雄性大鼠中隨機(jī)選擇6只大鼠作為正常對(duì)照組，其余18只大鼠禁食不禁水12 h，次日使用，pH=4.2的檸檬酸鹽緩沖液配制濃度為2%的鏈脲菌素(STZ)溶液，按60 mg/kg劑量一次性腹腔注射，72 h后使用羅氏血糖儀測(cè)量大鼠尾尖血糖，以血糖持續(xù)大于16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。3只大鼠血糖值不達(dá)標(biāo)予以剔除，成功造模15只。

1.2.2 缺血再灌注模型制備糖尿病大鼠飼養(yǎng)1個(gè)月后，從中選擇6只作為糖尿病對(duì)照組，剩余9只糖尿病大鼠作為缺血再灌注組，使用3%戊巴比妥鈉按60 mg/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，消毒備皮后，沿腹壁正中線切開長(zhǎng)約3 cm切口，鈍性剝離腹主動(dòng)脈和右側(cè)髂總動(dòng)脈，使用動(dòng)脈夾分別于髂腰動(dòng)脈水平下0.5 cm夾閉腹主動(dòng)脈，于髂總動(dòng)脈分叉處下1 cm夾閉右側(cè)髂總動(dòng)脈，鹽水紗布保護(hù)切口，60 W小臺(tái)燈照射保溫。另沿右側(cè)腹股溝韌帶剪開長(zhǎng)約2 cm切口，鈍性剝離股動(dòng)脈，使用動(dòng)脈夾于腹股溝水平處夾閉股動(dòng)脈，計(jì)時(shí)3 h后打開動(dòng)脈夾恢復(fù)血供，逐層縫合肌肉和皮膚。手術(shù)過(guò)程中2只大鼠死亡，7只造模成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 電生理測(cè)定手術(shù)7 d后，全部大鼠使用3%的戊巴比妥鈉麻醉，俯臥位固定，沿坐骨神經(jīng)走向縱向切開大鼠右下肢皮膚、肌肉，鈍性剝離坐骨神經(jīng)，37℃液態(tài)石蠟油保濕，使用廠家提供的電極鉤(共7個(gè)電極鉤，等間距固定，7個(gè)電極鉤從前到后依次與BL-420儀器中刺激電極正極、刺激電極負(fù)極、參考電極、第一記錄電極負(fù)極、第一記錄電極正極、第二記錄電極負(fù)極、第二記錄電極正極相連)鉤住坐骨神經(jīng)。打開電腦軟件，選擇神經(jīng)干興奮傳導(dǎo)速度測(cè)定，使用系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)(刺激波為方波、刺激強(qiáng)度1 v)，輸入2個(gè)記錄電極之間的距離0.8 cm后，測(cè)量坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和動(dòng)作電位波幅。

1.3.2 形態(tài)學(xué)觀察電生理檢測(cè)后，截取一段坐骨神經(jīng)放入3%的戊二醛中固定1周，然后放入1%的四氧化鋨中固定1.5 h，經(jīng)50%～100%酒精逐級(jí)脫水、環(huán)氧樹脂和丙酮混合液中浸透、環(huán)氧樹脂812+815包埋后，超薄切片機(jī)制作半薄切片(1～3 um)和超薄切片(50～70 nm)。半薄切片使用甲苯胺藍(lán)染色，光鏡下觀察坐骨神經(jīng)形態(tài)，使用Leica Qwin Plus圖像采集系統(tǒng)采集圖片，采用Adobe Photoshop Cs4圖像分析軟件進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)量分析;超薄切片使用鈾-鉛染色，透射電鏡下觀察坐骨神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。首先檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性，結(jié)果顯示各組數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)性，其中2組數(shù)據(jù)不滿足方差齊性。使用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，對(duì)于滿足方差齊性的數(shù)據(jù)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，對(duì)于不滿足方差齊性的數(shù)據(jù)兩兩比較采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)定為α=0.05。

2 測(cè)量結(jié)果

2.1 電生理測(cè)定

表1顯示，糖尿病缺血再灌注大鼠坐骨傳導(dǎo)速度、坐骨神經(jīng)動(dòng)作電位波幅與糖尿病大鼠和正常大鼠比較均明顯下降(P＜0.01);糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、坐骨神經(jīng)動(dòng)作電位波幅與正常大鼠比較下降(P＜0.01)。

表1 各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和動(dòng)作電位波幅(±s)

表1 各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和動(dòng)作電位波幅(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01，與糖尿病組比較:##P＜0.01

組別鼠數(shù)(n)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(m/s)動(dòng)作電位波幅(mv) 648.97±6.3711.59±1.63糖尿病組639.17±4.77＊＊9.31±0.90＊＊缺血再灌注組726.53±3.85＊＊##6.86±0.75＊＊##正常組

2.2 坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察

表2圖1顯示，光鏡下觀察并與正常大鼠比較，糖尿病缺血再灌注大鼠坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維密度明顯下降(P＜0.01)，異常有髓神經(jīng)纖維密度、異常有髓神經(jīng)纖維所占比率、有髓神經(jīng)纖維髓鞘平均橫截面積均明顯上升(P＜0.01)。與糖尿病大鼠比較，糖尿病缺血再灌注大鼠坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維密度下降(P＜0.05)，有髓神經(jīng)纖維髓鞘平均橫截面積上升(P＜0.01)。

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)測(cè)量分析(±s)

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)測(cè)量分析(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，與糖尿病組比較:#P＜0.05，##P＜0.01。

組別鼠數(shù)(n)有髓神經(jīng)纖維密度(條/mm2)異常有髓神經(jīng)纖維密度(條/mm2)異常有髓神經(jīng)纖維所占比率(%)有髓神經(jīng)纖維髓鞘平均橫截面積(um2)正常組611881.9±892.6375.0±166.73.1±1.426.6±2.4糖尿病組610020.8±1156.4＊＊916.7±225.2＊＊9.5±3.4*32.6±3.2＊＊缺血再灌注組78601.2±1143.0＊＊#1261.9±461.3＊＊14.5±4.7＊＊39.9±4.5＊＊##

圖2顯示，電鏡下觀察并與正常大鼠和糖尿病大鼠比較，糖尿病缺血再灌注大鼠神經(jīng)纖維密度明顯下降，分布不均勻，神經(jīng)內(nèi)膜明顯水腫，髓鞘增厚、迂曲、裂解、脫落，且呈波浪狀或氣泡狀，軸索萎縮，無(wú)髓神經(jīng)明顯減少。

3 討論

糖尿病周圍神經(jīng)病變屬于糖尿病慢性并發(fā)癥，糖尿病患者在血糖控制不佳的情況下，往往需要5～10年左右才能夠形成明顯的周圍神經(jīng)病變。目前廣泛使用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物作為DPN研究的主要?jiǎng)游锬Ｐ停淙秉c(diǎn)是周圍神經(jīng)損傷程度較輕。由于實(shí)驗(yàn)周期的限制，多數(shù)藥理實(shí)驗(yàn)在DPN尚未完全形成時(shí)即開始給藥，實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能反映藥物的預(yù)防性治療作用。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)［4-5］，缺血可以引起糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變，缺血再灌注能夠進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞軸索變性并導(dǎo)致雪旺細(xì)胞凋亡。在骨外科，缺血再灌注損傷是常見的臨床問(wèn)題［6］，由于DPN患者常常合并周圍血管病變等多種并發(fā)癥，缺血再灌注對(duì)DPN患者周圍神經(jīng)的損傷會(huì)更嚴(yán)重，往往可以引起嚴(yán)重的周圍神經(jīng)病變。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)暫時(shí)阻斷糖尿病大鼠腹主動(dòng)脈、髂總動(dòng)脈和股動(dòng)脈，造成大鼠坐骨神經(jīng)缺血再灌注損傷，希望在短期內(nèi)建立損傷程度較重的DPN動(dòng)物模型。

目前大鼠下肢缺血再灌注模型建立主要采用止血帶法和動(dòng)脈結(jié)扎法。止血帶法的優(yōu)點(diǎn)是創(chuàng)傷小、易操作、無(wú)需手術(shù)，但由于捆綁力度不易控制，使得各實(shí)驗(yàn)組在缺血程度、造模成功等方面難以取得一致，且其只是對(duì)缺血再灌注損傷的簡(jiǎn)單復(fù)制，缺血再灌注損傷的發(fā)生缺乏客觀性、真實(shí)性。動(dòng)脈結(jié)扎法可以很好地避免上述缺點(diǎn)，但是需要手術(shù)，會(huì)增加動(dòng)物的死亡率。由于大鼠下肢側(cè)枝循環(huán)豐富，結(jié)扎一條血管不能造成坐骨神經(jīng)明顯缺血，而結(jié)扎全部血管，會(huì)明顯增加手術(shù)難度和動(dòng)物的死亡率。本實(shí)驗(yàn)在熟悉大鼠下肢解剖結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上參考多篇文獻(xiàn)［5-11］，最終選擇腹主動(dòng)脈、髂總動(dòng)脈和股動(dòng)脈3條血管，這些血管是營(yíng)養(yǎng)坐骨神經(jīng)的主要血管，且管徑較粗，易分離結(jié)扎，可以明顯降低手術(shù)難度和手術(shù)時(shí)間，提高手術(shù)成功率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用此方法可以在短期內(nèi)造成糖尿病大鼠嚴(yán)重的周圍神經(jīng)病變，為DPN研究提供了一種新的動(dòng)物模型。

圖1 大鼠坐骨神經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色(×400)

圖2 大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)(×5000)

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Effect of sciatic nerve with limb ischemia reperfusion in diabetic rats

HUANG Da，LI Ming-di，ZHENG Ya-lin，WANG Qiu-hong，LIN Lan△
(Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China)

Objective:To investigate the effects of lower limb ischemia-reperfusion on sciatic nerve in diabetic rats. Methods:Twenty-four male SD rats were divided into two groups:normal control group(n=6)and diabetic group(n=18)，and the model rats suffering from diabetes were induced by streptozotocin.After feeding for one month，choose part of the model rats suffering from diabetes(n=9)as the ischemia-reperfusion group，and keep their abdominal aorta，common iliac artery and femoral artery blocked for 3 hours.After 7-day perfusion，measure the sciatic nerve conduction velocity and action potential amplitude，and observe sciatic morphological changes by light microscopy，electron microscopy.Results: For the diabetic rats from ischemia-reperfusion group，their sciatic nerve conduction velocity and action potential amplitude decreased obviously，along with the endoneurial edema，nerve fiber density decreasing，the number of abnormal nerve fibers increasing，myelin swelling，axonal atrophy and other changes.Conclusion:Lower limb ischemia-reperfusion can cause serious injury to the sciatic nerve in diabetic rats，and this method can establish diabetic peripheral neuropathy animal model in a short term.

Diabetic peripheral neuropathy;Ischemia-reperfusion;Nerve conduction velocity;Morphology

R587.1

:B

:1006-3250(2015)05-0517-03

2015-01-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目-從ICAM-1介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡探討中藥干預(yù)糖尿病周圍神經(jīng)病變機(jī)制(81173445)

黃達(dá)(1983-)，男，河北唐山人，在讀博士，從事糖尿病及其并發(fā)癥的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

△通訊作者:林蘭(1938-)，女，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院首席研究員，從事糖尿病、甲狀腺等內(nèi)分泌疾病的中西醫(yī)結(jié)合臨床與研究，E-mail:linlan05@163.com。