陳新宇，楊 浩，蔡虎志，盧 青，陳青揚，陳毅君

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

JNK信號通路抑制劑體內(nèi)應(yīng)用方法研究

陳新宇1，楊 浩2，蔡虎志2，盧 青1，陳青揚2，陳毅君2

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

目的 探討JNK信號通路抑制劑(SP600125)體內(nèi)長期實驗的應(yīng)用方法。方法將40只新西蘭兔隨機分為八組：空白對照組、模型對照組、JNK高劑量組、JNK低劑量組、JNK空白組、DMSO模型組、DMSO空白組、陽性對照組。自實驗第一天開始各組給予相應(yīng)處理，連續(xù)4周。4周末檢測實驗兔心肌組織JNK總蛋白及蛋白磷酸化和基因表達水平。結(jié)果經(jīng)阿霉素干預(yù)后，各組實驗組心肌P-JNK表達均不同程度上調(diào)，其中以模型對照組、DMSO模型組上調(diào)最為明顯(P＜0.05)。JNK低、高劑量組和陽性對照組心肌P-JNK表達水平上調(diào)較模型對照組緩慢(P＜0.05)，其中以JNK高劑組心肌P-JNK水平上調(diào)最為緩慢(P＜0.05)。各實驗組間JNK總蛋白、JNK mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論連續(xù)4周小劑量皮下注射JNK信號通路抑制劑可以顯著下調(diào)p-JNK的表達，該方法能夠為體內(nèi)長期實驗研究提供思路。

JNK信號通路；抑制劑；DMSO；體內(nèi)應(yīng)用

JNK信號傳導(dǎo)通路是MAPK信號通路家族成員之一，它是廣泛存在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞外界信號從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，在眾多的疾病進展過程中起著重要的作用。國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)較深透的探究了該信號通路，在對于該信號通路的研究過程中，抑制劑的應(yīng)用是最常見的研究思路。

JNK信號通路抑制劑(SP600125)是絲/蘇氨酸激酶廣譜抑制劑，有效抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)，其體外實驗和體內(nèi)短期實驗已較為成熟，但體內(nèi)長期實驗如何應(yīng)用SP600125來干預(yù)JNK的通路蛋白則罕有報道。本實驗旨在探索長期體內(nèi)應(yīng)用JNK信號通路抑制劑(SP600125)的方法，為相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 健康普通級雄性新西蘭兔40只，質(zhì)量(1.85±0.11)kg，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。動物許可證批號：SCXK(湘)2009-0012。在自由飲食、光/暗周期為12 h/12 h(光照時間為6:00～18:00)、背景噪音為(40±10)dB、溫度(20±3)℃條件下飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。

1.1.2 主要藥物與試劑 (1)阿霉素：深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(H44024359)；(2)烏拉坦：山東齊魯興華制藥有限公司(H37022259)；(3)生理鹽水：湖南科倫制藥有限公司(H43020455)；(4)依那普利：江蘇揚子江藥業(yè)(H31021937)；(5)JNK抑制劑：美國SELLECK公司；(6)P-JNK抗體：美國Santa Cruz公司(sc-12882)；(7)JNK抗體：美國 Santa Cruz公司(sc-572)；(8)DMSO：美國SELLECK公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 采用完全隨機分組設(shè)計，將40只實驗兔按體重從小到大排列，用記號筆在右耳內(nèi)側(cè)進行編號，查隨機數(shù)字表，將實驗兔隨機分為8組，分別為：空白對照組、模型對照組、JNK高劑量組、JNK低劑量組、JNK空白組、DMSO模型組、DMSO空白組、陽性對照組，每組實驗兔5只。

1.2.2 JNK病理模型表達誘導(dǎo) 參照文獻[1-2]，將注射用鹽酸阿霉素用生理鹽水稀釋成1.0 mg/ml溶液，模型對照組、JNK高劑量組、JNK低劑量組、DMSO模型組、陽性對照組耳緣靜脈注射，每次1.0 ml/kg，每周2次，連續(xù)4周。同時，空白對照組、JNK空白組、DMSO空白組中實驗兔耳緣靜脈注入0.9%生理鹽水1 ml/kg。

1.2.3 給藥方法 將JNK抑制劑SP600125用DMSO配成1 mg/ml母液，于耳緣靜脈注射阿霉素的第一天開始，JNK低劑量組、JNK高劑量組、JNK空白組分別按照20 μg/(kg·d)、40 μg/(kg·d)、40 μg/(kg·d)配以生理鹽水1 ml進行皮下注射。DMSO模型組、DMSO空白組按40 μl/(kg·d)配以生理鹽水1 ml進行皮下注射；陽性對照組按人-兔體表面積換算后依那普利按5 mg/(kg·d)配以蒸餾水10 ml進行灌胃[3-4]?？瞻讓φ战M以等量生理鹽水處理。各組連續(xù)干預(yù)4周。

1.3 樣本采集與檢測

1.3.1 心肌組織總蛋白質(zhì)提取 為觀察及檢測模型兔各項指標(biāo)的的變化，將實驗兔麻醉處死后迅速取左心室面心肌組織，置于干冰暫時凍存。把凍存的心肌組織轉(zhuǎn)移至預(yù)先稱質(zhì)量的離心管中，稱出樣品的質(zhì)量。然后按照約1:8(質(zhì)量:體積)的比例加入組織裂解液混合，冰浴上機械勻漿，渦旋混勻，靜置1 h，18 000×g、4℃離心30 min，取上清即為組中的總蛋白質(zhì)，按Bradford方法測定蛋白質(zhì)濃度，然后分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Western-blot檢測 將50 μg的心肌總蛋白加入2×SDS上樣緩沖液(0.1 mol/L Tris pH 6.8，0.2 mol/L DTT，4%SDS，20%甘油，0.02%溴酚蘭)，100℃變性8 min，上樣，恒定電流，前15 min 16 mA/gel電泳，然后32 mA/gel電泳至底部。電轉(zhuǎn)印按膜面積(0.8 mA/cm2)設(shè)定電流，轉(zhuǎn)膜2 h。然后再用含3%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h。將膜取出，置于雜交袋中，分別加入抗JNK、P-JNK抗體，4℃過夜。TBS-Tween20漂洗10 min×3次，將膜取出，置于另一雜交袋中，加入酶標(biāo)二抗，室溫雜交2 h。TBST漂洗10 min×3次。ECL曝光顯像、掃描、保存并分析。

1.3.3 RT-PCR分析 取左心室面心肌組織，參照TRI quick Reagent說明書，采用Trizol試劑一步法提取心肌組織的總RNA，紫外分光光度計測定RNA的純度并定量。然后根據(jù)Genebank中JNK基因序列進行引物設(shè)計，依照PCR反應(yīng)試劑盒說明書進行JNK基因表達的RT-PCR分析。最后凝膠成像系統(tǒng)分析，計算光密度值?；蛐蛄幸镌O(shè)計如下：JNKmRNA GenBank：AF014401.1；LEFT PRIMER 5'-CCGTCAGAATAAC-GAGACAAAAT-3'；RIGHT PRIMER 5'-AAGCCAGAGTCCTTCACAGACAA-3'；PRODUCTSIZE:101；GADPH GenBank:AF261085.1；LEFTPRIMER5'-ACCTTCAACACC-CCAGCCATGT ACG-3'；RIGHTPRIMER5'-CTGATCCACATCT-GC T GGAAGGTGGCA-3'；PRODUCTSIZE:134。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)資料進行正態(tài)性檢驗，用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件包進行處理，計量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組均數(shù)組間比較采用單因素方差分析，若方差齊時采用LSD法，若方差不齊時采用Tamhane'T2法，顯著性水準(zhǔn)P=0.05。

2 結(jié)果

2.1 動物數(shù)量變化 實驗過程中，DMSO模型組、JNK高劑量組因反復(fù)腹瀉，于實驗結(jié)束前各死亡一只實驗兔，考慮死亡原因為阿霉素推注速度過快引發(fā)急性中毒所致，正常對照組均生長良好。

2.2 實驗后各組間心肌JNK的表達 實驗后各組實驗兔的心肌JNK表達見表1、圖1。表1顯示阿霉素干預(yù)后，各組心肌P-JNK均不同程度上調(diào)，與正常對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中以模型對照組上調(diào)最為明顯(P＜0.05)。JNK低、高劑組和陽性對照組心肌P-JNK表達水平上調(diào)較模型對照組緩慢(P＜0.05)，其中以JNK高劑組心肌P-JNK水平上調(diào)最為緩慢(P＜0.05)。DMSO對照組及空白組心肌P-JNK水平分別與模型對照組、空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；各組實驗兔各組間JNK總蛋白水平和JNK mRNA水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。這表明模型對照組JNK磷酸化蛋白上調(diào)，DMSO和JNK抑制劑對于正常心肌JNK磷酸化蛋白表達無影響，但經(jīng)過依那普利和JNK抑制劑干預(yù)后的各組實驗兔的JNK磷酸化蛋白均較模型對照組均有所下降，其中JNK40μg/kg較20μg/kg效果明顯。

表1 實驗后各組間心肌JNK的表達(±s)

表1 實驗后各組間心肌JNK的表達(±s)

注：與正常對照組比較，aP＞0.05，bP＜0.05；與模型對照組比較，cP＜0.05，dP＞0.05；與JNK低劑組比較，eP＜0.05；與JNK空白組比較，fP＜0.05。

空白對照組模型對照組JNK低劑量組JNK高劑量組JNK空白組DMSO模型組DMSO空白組陽性對照組5 5 5 4 5 4 5 5 0.29±0.005 0.28±0.002a0.28±0.002a0.29±0.003a0.29±0.001a0.29±0.003a0.28±0.002a0.29±0.002a0.37±0.011 0.77±0.010b0.64±0.012bc0.56±0.012bcef0.28±0.011bce0.76±0.010bde0.38±0.012acef0.70±0.012bce0.27±0.020 0.28±0.019a0.28±0.018a0.27±0.020a0.28±0.018a0.26±0.020a0.27±0.019a0.27±0.018a

圖1 JNK的表達

3 討論

MAPK信號通路廣泛存在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，其可被一系列的細(xì)胞外信號及刺激而激活，經(jīng)大量的研究證實其與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。JNK信號通路是MAPK信號通路的成員之一，它是細(xì)胞外界信號由細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者[5]。經(jīng)國內(nèi)外學(xué)者證實JNK的基因主要有三個亞型，即JNK1、JNK2和JNK3。JNK1和JNK2在組織中廣泛表達，JNK3僅在腦、心和睪丸中表達[6]。大量的基礎(chǔ)研究證實的JNK信號通路參與了細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞骨架構(gòu)建、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞惡變等多種生物學(xué)反應(yīng)，其主要通過JNK磷酸化蛋白的表達來調(diào)控相關(guān)反應(yīng)[7-8]。國內(nèi)外學(xué)者以該通路為突破口，對于許多疾病的病因開始探索，如Bogoyevitch等證實了在慢性心衰的動物模型中JNK的表達升高[9]；研究還證實高血壓導(dǎo)致的心臟疾病中有p38和JNK的激活，同時在心肌細(xì)胞中表達JNK的上游激活因子，可以抑制心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)，延緩心力衰竭[10]；在衰竭的心肌細(xì)胞中活性氧簇(ROS)可以刺激位于JNK和p38上游區(qū)的細(xì)胞凋亡信號激酶-l，它的過度表達激活核因子κB (NF-κB)可導(dǎo)致心肌肥厚，以及促進凋亡信號激酶的激活進而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[11-12]。

在細(xì)胞信號通路是實驗研究中，抑制劑具有無可替代的地位。SP600125是ATP競爭性的c-Jun氨基末端激酶(JNK)選擇性抑制劑，可顯著抑制JNK介導(dǎo)的MAPK激活。同時SP600125也是一種高選擇性JNK抑制劑，可作用于JNK1，JNK2和JNK3，經(jīng)證實，比作用于MKK4選擇性高10倍，比作用于MKK3、MKK6、PKB和PKCα選擇性高25倍，比作用于ERK2、p38、Chk1、EGFR等選擇性高100倍。目前現(xiàn)有文獻報道的抑制劑的使用方法主要方法為體外的激酶實驗、細(xì)胞實驗以及在體動物實驗。體外激酶實驗和細(xì)胞實驗證實SP600125可作用于多種細(xì)胞，如：Jurkat T細(xì)胞、從人臍血或外周血分離的Th0細(xì)胞等，抑制c-Jun磷酸化、抑制細(xì)胞活化和分化，且抑制炎癥多種因子的表達，如：COX-2、IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表達[13-15]。相關(guān)研究顯示SP600125也抑制香烴受體(AhR)Mps1，和一系列其他絲/蘇氨酸激酶，包括Aurora激酶A、FLT3、MELK和TRKA[16-18]。

SP600125的體內(nèi)應(yīng)用研究亦有部分報道，但使用方法多為大劑量靜脈注入或口服后，在短時間內(nèi)即處死實驗動物，如：仇愛剛等[19]在SP600125對大鼠肝缺血再灌注損傷保護作用的研究中，在術(shù)前半小時腹腔注射SP600125 15 mg/kg。目前尚無抑制劑長期體內(nèi)小劑量應(yīng)用的文獻報道，因此若要長期觀察慢性疾病動物模型的病理發(fā)展過程和SP600125對其的干預(yù)作用，則需要更多有價值的實驗和文獻來體現(xiàn)。本研究采用阿霉素法誘導(dǎo)JNK信號通路發(fā)生異常改變，摸索出SP600125在體內(nèi)長期實驗過程中較為合適的使用方法，能夠為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供一定的理論依據(jù)和研究思路。

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In vivo application method of JNK signal pathway inhibitor(SP600125).

CHEN Xin-yu1,YANG Hao2,CAI Hu-zhi2, LU Qing1,CHEN Qing-yang2,CHEN Yi-jun2.1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha 410007,Hunan,CHINA;2.Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha 410208, Hunan,CHINA

Objective To explore the method for the long-termin vivoapplication of JNK signaling pathway inhibitor(SP600125).MethodsForty New Zealand rabbits were randomly divided into 8 groups:blank control group, model control group,high-dose JNK group,low-dose JNK group,JNK blank group,DMSO model group,DMSO blank group,positive control group.All the experimental groups received the corresponding treatment for 4 weeks.After 4 weeks,the myocardial tissues of experimental rabbits were separated under anesthesia,and JNK total protein and p-JNK protein were measured bn Western blot.JNK mRNA expression was measured by RT-PCR.ResultsAfter intervention of ADR,myocardial P-JNK expression in each experimental group increased to different degrees,and the increases in the model control group,DMSO model group were the most significant(P＜0.05).Compared with model control group,the increases in myocardial P-JNK expression in low-dose JNK group,high-dose JNK group and positive control group were less significant(P＜0.05),and the myocardial P-JNK levels in high-dose JNK group increased most slowly(P＜0.05).The total protein of JNK,JNK mRNA expression of the experimental groups showed no significant difference(P＞0.05).ConclusionLow-dose subcutaneous injection of JNK signaling pathway inhibitor for four weeks can significantly lower the expression of p-JNK.

JNK signaling pathway;Inhibitor;DMSO;In vivoapplication

R-332

A

1003—6350（2015）08—1093—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.08.0393

2014-11-16)

國家自然科學(xué)基金(編號：81173213/H2708)；湖南省科技廳科技計劃項目(編號：2014SK3242)

陳新宇。E-mail：chenxinyuchen@163.com