陳飛，胡玢婕，趙虎

(復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200040)

MALDI-TOF MS在臨床微生物樣本直接檢測(cè)中的應(yīng)用

陳飛，胡玢婕，趙虎

(復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200040)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新興的微生物鑒定技術(shù)，與傳統(tǒng)的生化表型鑒定方法和分子生物學(xué)方法相比，MALDI-TOF MS具有操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。鑒于其對(duì)培養(yǎng)出的純菌落鑒定的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，MALDI-TOF MS也可被應(yīng)用于臨床樣本的直接檢測(cè)，包括陽性血培養(yǎng)瓶、中段尿、腦脊液等。本文主要就MALDI-TOF MS用于直接檢測(cè)臨床樣本的原理、流程、鑒定效能及其研究進(jìn)展等方面做一綜述。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜;直接檢測(cè);微生物鑒定;臨床樣本

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種新型軟電離有機(jī)質(zhì)譜，作為一種新興的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域。同時(shí)作為一項(xiàng)新興的微生物鑒定技術(shù)，受到了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。與傳統(tǒng)的生化表型鑒定方法和分子生物學(xué)方法相比，MALDI-TOF MS具有操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。早在1975年，ANHALT等[1]利用質(zhì)譜儀結(jié)合高溫裂解技術(shù)第1次完成了細(xì)菌的鑒定，從此拉開了質(zhì)譜鑒定細(xì)菌的“序幕”。隨著質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，近年來，MALDITOF MS已經(jīng)成功應(yīng)用于微生物的鑒定，顯示了其在細(xì)菌、酵母菌等鑒定方面均具有良好的應(yīng)用價(jià)值。眾多的研究表明，MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)培養(yǎng)出的純菌落進(jìn)行菌種鑒定具有很高的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性，對(duì)常見細(xì)菌和酵母菌的屬的鑒定率能達(dá)到97%～99%，種的鑒定率也能達(dá)到85%～97%;另外，MALDI-TOF MS大大縮短了細(xì)菌鑒定的時(shí)間，而且其成本也較常規(guī)鑒定方法低[2-3]。除此之外，MALDI-TOF MS已經(jīng)能夠成功地用于部分微生物亞種水平的鑒定和細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)，但這種方法在大多數(shù)情況下是應(yīng)用于培養(yǎng)出的純菌落的鑒定[3]。

如果能夠從臨床樣本中直接檢測(cè)細(xì)菌/真菌，突破細(xì)菌/真菌培養(yǎng)陽性率低、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)的瓶頸，為細(xì)菌/真菌感染性疾病的診療提供更快、更準(zhǔn)確的病原學(xué)依據(jù)，將對(duì)臨床及時(shí)控制細(xì)菌/真菌感染性疾病起到更大的作用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已嘗試將質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于臨床樣本的直接檢測(cè)，并取得了顯著的進(jìn)展。本文就MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床樣本的直接檢測(cè)應(yīng)用作一綜述。

一、MALDI-TOF MS檢測(cè)原理

MALDI-TOF MS技術(shù)用于微生物鑒定的實(shí)質(zhì)就是檢測(cè)具有屬、種或亞型特異性的生物標(biāo)志的質(zhì)量信號(hào)，主要是微生物菌體內(nèi)高豐度、表達(dá)穩(wěn)定和進(jìn)化保守的核糖體蛋白。MALDI-TOF MS儀器主要由基質(zhì)輔助激光解吸離子源(MALDI)和飛行時(shí)間質(zhì)量檢測(cè)器(TOF)兩部分組成。MALDI的原理是用一定強(qiáng)度的激光照射樣本與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量而汽化，并迅速降解，使樣本分解吸附，基質(zhì)和樣本之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移從而使樣本分子發(fā)生電離;TOF的原理是帶有電荷的樣本分子在電場(chǎng)作用下加速飛過飛行管道，因?yàn)殡x子的質(zhì)荷比與離子的飛行時(shí)間呈正比，所以不同質(zhì)量的離子因達(dá)到檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，以離子峰為縱坐標(biāo)、離子質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)形成特征性的質(zhì)量圖譜。將不同種屬微生物經(jīng)MALDI-TOF分析所形成的質(zhì)量圖譜與數(shù)據(jù)庫中的參考圖譜進(jìn)行比較，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)微生物種或菌株的區(qū)分和鑒定[2]。

二、MALDI-TOF MS直接檢測(cè)臨床樣本的流程

臨床樣本直接檢測(cè)的流程主要包括3個(gè)部分:臨床樣本的預(yù)處理、樣本上機(jī)檢測(cè)和對(duì)比蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫得出鑒定結(jié)果。由于目前報(bào)道最多的臨床樣本是陽性血培養(yǎng)瓶和中段尿樣本，下面將以這二者為例介紹其直接檢測(cè)的流程，其它臨床樣本的檢測(cè)流程與之類似。

(一)臨床樣本預(yù)處理

MALDI-TOF MS直接用于臨床樣本的檢測(cè)有2個(gè)基本的要求:(1)臨床樣本中細(xì)菌的量。為了得到準(zhǔn)確的鑒定圖譜，MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)置于靶板上的細(xì)菌的最低檢測(cè)限約為(1×104)～(1×106)cfu/mL。若要直接檢測(cè)擬似血流感染的血液樣本以及擬似泌尿系統(tǒng)感染的中段尿等臨床樣本中的病原菌，首先必須富集細(xì)菌;(2)臨床樣本的質(zhì)。由于血液和血培養(yǎng)瓶中的大分子成分如血紅蛋白和其它蛋白成分、尿液中的白細(xì)胞等有機(jī)成分會(huì)干擾細(xì)菌的譜峰，所以直接檢測(cè)前需要采取預(yù)處理措施去除這些干擾因素。

1.陽性血培養(yǎng)瓶直接檢測(cè)直接檢測(cè)陽性血培養(yǎng)瓶的細(xì)菌濃度常常需要1×107cfu/mL[2，4]。由于在血流感染患者血液中的細(xì)菌量常常很低(最低可＜1～10 cfu/mL)，因此對(duì)血樣本的直接檢測(cè)需要一個(gè)增菌的過程，即采用血培養(yǎng)瓶增菌。目前已報(bào)道的陽性血培養(yǎng)病原菌預(yù)處理程序各不相同，但預(yù)處理過程主要包含了以下2個(gè)步驟: (1)將細(xì)菌從血細(xì)胞中分離出來。先應(yīng)用溫和去污劑(如吐溫-80、十二磺基硫酸鈉、皂素等)將血液中的血細(xì)胞溶解，然后通過不同的流程(離心、洗滌)去除其它的干擾因素，純化要鑒定的細(xì)菌樣本;(2)將菌體中的蛋白質(zhì)抽提出來。最常用的是混合溶劑處理法，使用甲酸/乙腈溶液對(duì)樣本進(jìn)行處理來抽提蛋白，利用2種溶劑的混合作用將菌體表面的蛋白和存在于細(xì)胞內(nèi)的低相對(duì)分子質(zhì)量的高豐度蛋白提取出來，實(shí)現(xiàn)對(duì)菌株的鑒定。雖然至今尚沒有規(guī)范化的處理程序，不過目前市場(chǎng)上已有商品化的陽性血培養(yǎng)瓶預(yù)處理試劑盒Sepsityper kit(Bruker)可以提高鑒定分?jǐn)?shù)和鑒定準(zhǔn)確率，但是花費(fèi)比較高，處理程序也費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)[5]。另外，HAMMARSTR?M等[6]建立了一種基于聲學(xué)捕捉和集成選擇性富集目標(biāo)(integrated selective enrichment target，ISET)的新方法用于富集樣本中的細(xì)菌，快速、準(zhǔn)確并且簡(jiǎn)化了人工操作，有望替代傳統(tǒng)的以離心為基礎(chǔ)的分離方法。

2.中段尿樣本要取得一個(gè)較高的鑒定成功率，直接檢測(cè)中段尿樣本中病原菌至少需要的細(xì)菌數(shù)量是1×105cfu/mL[7-8]。對(duì)尿樣本的預(yù)處理程序較為簡(jiǎn)單，主要有下面幾個(gè)步驟:低速離心去除白細(xì)胞，高速離心收集細(xì)菌，沉淀，經(jīng)過洗滌、離心之后進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取(常用的是甲酸、乙腈)，經(jīng)高速離心后取1 μL上清涂布到MALDI的靶板上，在室溫下干燥后即可進(jìn)行檢測(cè)。

(二)MALDI-TOF MS分析

目前主要有4種MALDI-TOF MS系統(tǒng)[9]: MALDI Biotyper系統(tǒng)(Bruker Daltonics，德國(guó))，VITEK MS系統(tǒng)(BioMérieux，Marcy l’Etoile，法國(guó))，theAXIMA@SARAMIS數(shù)據(jù)庫(AnagnosTec，德國(guó))和the Andromas(Andromas，法國(guó))，其中前2種質(zhì)譜系統(tǒng)已獲得中國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局許可證，可以用于臨床樣本的檢測(cè)。

在進(jìn)行質(zhì)譜分析前，應(yīng)根據(jù)不同的檢測(cè)對(duì)象和使用的激光類型選擇合適的基質(zhì)?；|(zhì)由基質(zhì)復(fù)合物和基質(zhì)溶劑組成。常用溶劑有:乙醇、乙腈和一種強(qiáng)酸如三氟乙酸、甲酸等。常用的基質(zhì)是2，5-二羥基苯甲酸(2，5-dihydroxybenzoic acid，DHB)、ɑ-氰基-4-羥基肉桂酸(ɑ-cyano-4-hydroxycinnamic acid，ɑ-CHCA)、3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(sinapinic acid，SA)等。將經(jīng)過提取的微生物樣本細(xì)胞內(nèi)容物與等量的基質(zhì)溶液(通常是1 μL)混合或分別點(diǎn)加在樣本靶板上，待室溫條件下干燥后(使得樣本與基質(zhì)共結(jié)晶)上機(jī)檢測(cè)即可。

(三)鑒定結(jié)果分析

將質(zhì)譜檢測(cè)得到的譜峰與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行模式匹配，得到一個(gè)鑒定分?jǐn)?shù)?；谲浖o出的在列表中第1種微生物的鑒定分?jǐn)?shù)，根據(jù)各自質(zhì)譜分析系統(tǒng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)得出檢測(cè)結(jié)果。目前文獻(xiàn)報(bào)道有2種判斷標(biāo)準(zhǔn):第1種是由STEVENSON等[10]提出的，鑒定結(jié)果按照匹配程度進(jìn)行打分，分值在0～3之間。當(dāng)?shù)玫降蔫b定分?jǐn)?shù)≥2.0時(shí)，表示待測(cè)菌株有較大的把握被鑒定到種的水平;鑒定分?jǐn)?shù)在1.7和2.0之間時(shí)，表示菌株被鑒定到屬的水平，分值＜1.7表示產(chǎn)生的鑒定結(jié)果不可信。第2種標(biāo)準(zhǔn)是LA SCOLA等[11]提出的，當(dāng)一個(gè)樣本經(jīng)過4次點(diǎn)樣鑒定，當(dāng)列表中第1種微生物的鑒定結(jié)果均一致，并且至少2次的鑒定結(jié)果鑒定分?jǐn)?shù)≥1.900，或者4次的鑒定分?jǐn)?shù)均≥1.200，表明微生物能被正確鑒定。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過改進(jìn)上述的鑒定標(biāo)準(zhǔn)可以得到更好的鑒定效果，ROSSELLó等[12]認(rèn)為在臨床樣本直接鑒定時(shí)，鑒定分?jǐn)?shù)要比直接純培養(yǎng)的低，可能會(huì)對(duì)分析結(jié)果造成干擾，而廠商推薦的鑒定標(biāo)準(zhǔn)有些嚴(yán)格，只有得到很高的鑒定分?jǐn)?shù)結(jié)果才是被接受的。因此提出新的標(biāo)準(zhǔn)增加可接受的準(zhǔn)確鑒定數(shù):當(dāng)一個(gè)樣本4次點(diǎn)樣中至少有2次的鑒定結(jié)果一致，并且對(duì)列表中的第1個(gè)微生物種的鑒定分?jǐn)?shù)均≥1.4時(shí)，即表示能夠準(zhǔn)確鑒定，這種標(biāo)準(zhǔn)與純培養(yǎng)的鑒定結(jié)果有100%的符合率。NONNEMANN等[5]、GORTON等[13]將種的鑒定分?jǐn)?shù)降到1.5，可以將種的鑒定率從56%提升到76%、54%提升到63%。以上均提示了廠商推薦的cut-off值比較保守，使得鑒定的敏感性降低。此外，由于目前的數(shù)據(jù)庫尚不完善，對(duì)于部分菌株可能會(huì)出現(xiàn)鑒定失誤的情況，實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)在商品數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上建立和豐富自己的參考數(shù)據(jù)庫，以提升鑒定的準(zhǔn)確率。

三、MALDI-TOF MS在臨床樣本直接檢測(cè)中的應(yīng)用

從臨床樣本直接檢測(cè)微生物可以節(jié)省轉(zhuǎn)種培養(yǎng)的時(shí)間。目前已取得顯著進(jìn)展的是從血培養(yǎng)陽性樣本中直接檢測(cè)細(xì)菌和酵母樣真菌，而從中段尿和其他無菌體液樣本中的直接檢測(cè)也在快速發(fā)展。

(一)血流感染病原菌的快速檢測(cè)

血流感染的發(fā)病率和死亡率都相當(dāng)高，快速準(zhǔn)確的血流感染病原菌鑒定對(duì)于臨床抗菌藥物的合理使用和病愈率的提高至關(guān)重要。直接檢測(cè)能顯著減少鑒定時(shí)間(＜29 h)，使得在血培養(yǎng)陽性的第1個(gè)24 h內(nèi)接受適當(dāng)抗菌藥物治療的患者增加11%[14]。CLERC等[15]認(rèn)為基于MALDITOF MS對(duì)血培養(yǎng)陽性樣本的檢測(cè)可能會(huì)成為血培養(yǎng)陽性患者管理中除了革蘭染色報(bào)告之外的第2個(gè)關(guān)鍵步驟。近年來，有不少的研究應(yīng)用MALDI-TOF MS直接鑒定臨床微生物樣本，取得明顯進(jìn)展的是從血培養(yǎng)陽性樣本中直接鑒定細(xì)菌和酵母樣真菌[5，10，16]，而混合菌和厭氧菌等的鑒定還有待更多的研究。

1.鑒定效能(1)細(xì)菌:在引起血流感染常見菌的鑒定方面，MALDI-TOF MS技術(shù)已經(jīng)在腸桿菌科細(xì)菌、葡萄球菌等病原菌的直接鑒定方面取得了很好的鑒定結(jié)果。大量的研究評(píng)估了MALDI-TOF MS用于直接鑒定陽性血培養(yǎng)瓶的表現(xiàn)，不同文獻(xiàn)報(bào)道的種水平的鑒定率在54%～99%不等[5，10-11，17-19]，主要是由于所鑒定細(xì)菌種類/數(shù)量的不同，或是運(yùn)用了不同的預(yù)處理/提取方法，或是定義了不同的cut-off值。SCHMIDT等[19]、SCHUBERT等[20]應(yīng)用不同的操作程序直接鑒定陽性血培養(yǎng)瓶樣本，結(jié)果顯示103株代表臨床最常見的13個(gè)屬24個(gè)種的樣本中，MALDITOF MS準(zhǔn)確鑒定其中的72%(86.6%革蘭陰性菌，60.0%革蘭陽性菌);500例樣本中，其中革蘭陽性菌358例，革蘭陰性菌98例，總體種的鑒定率達(dá)到了86.5%，其中革蘭陽性菌是89.8%，革蘭陰性菌是86.3%。國(guó)內(nèi)最新的研究也顯示，陳峰等[21]運(yùn)用分離膠促凝管聯(lián)合MALDI-TOF MS直接檢測(cè)，革蘭陰性菌和革蘭陽性菌中有84.0%和75.0%能被準(zhǔn)確鑒定到種的水平;對(duì)于血流感染中最常見的病原菌的菌種鑒定符合率達(dá)到83.3%～96.9%。以上研究均顯示了MALDITOF MS在血流感染直接鑒定方面的良好表現(xiàn)，并呈現(xiàn)出了如下特點(diǎn):對(duì)革蘭陰性菌的鑒定率比革蘭陽性菌高;無莢膜的細(xì)菌較有莢膜的細(xì)菌(細(xì)胞壁難以破壞提取到足夠的菌體蛋白)的鑒定率高;混合細(xì)菌感染時(shí)鑒定能力有限，多數(shù)情況下只能鑒定出其中一種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌;對(duì)草綠色鏈球菌的鑒定效果較差(鑒定不出，或?qū)⒕彴Y鏈球菌鑒定為肺炎鏈球菌)[10-20]，需要進(jìn)行另外的確證試驗(yàn);(2)真菌:MALDI-TOF MS在鑒定酵母菌方面有較高的鑒定率。FERRONI等[18]、YAN等[16]的研究表明酵母菌鑒定的正確率可達(dá)91%～100%。但是也有學(xué)者得到了相反的結(jié)果，GORTON等[13]和PAOLUCCI等[22]直接鑒定的正確率只有56%和41%，可能是因?yàn)殍b定使用的血量過少(1.5 mL)，或是在處理樣本的過程中樣本的丟失導(dǎo)致了低鑒定率;(3)其它細(xì)菌:目前關(guān)于厭氧菌的直接鑒定的報(bào)道較少，并且顯示了鑒定成功率并不理想，可能是因?yàn)閰捬蹙鷮?duì)生長(zhǎng)條件的要求較為苛刻，導(dǎo)致增菌的數(shù)量達(dá)不到要求，還需要更多的研究來優(yōu)化其鑒定條件。

2.不同的檢測(cè)方法上述結(jié)果均是MALDITOF MS直接檢測(cè)報(bào)陽血培養(yǎng)瓶的樣本所得到的。有研究表明報(bào)陽血培養(yǎng)瓶的樣本也可以轉(zhuǎn)種到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行短暫孵育(如2～4 h)后再進(jìn)行鑒定，則具有更大的優(yōu)勢(shì)。KROUMOVA等[23]在質(zhì)譜法分析實(shí)施蛋白提取程序之前，將樣本富集到一個(gè)增菌培養(yǎng)基中孵育大約2 h后再進(jìn)行質(zhì)譜分析，同時(shí)達(dá)到增菌和減少血液成分干擾的目的，提升了鑒定分?jǐn)?shù)，使鑒定結(jié)果更可信; IDELEVICH等[24]將血培養(yǎng)陽性的樣本轉(zhuǎn)種到血平板孵育1.5、2、3、4、5、6、7、8、12和24 h(對(duì)照)，分別直接進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測(cè)，直到有可靠的到種水平的鑒定結(jié)果出現(xiàn)(鑒定分?jǐn)?shù)≥2.0)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)革蘭陽性球菌平均鑒定到種所需要的孵育時(shí)間是5.9 h，革蘭陰性桿菌平均鑒定到種所需要的孵育時(shí)間是2 h。如果增加了蛋白提取程序，革蘭陽性球菌的孵育時(shí)間將縮短至3.1 h，但對(duì)革蘭陰性桿菌的影響不明顯。這種方法可以有效地減少額外的人工操作時(shí)間和費(fèi)用。HONG等[25]的研究也表明，這種方法能得到可靠的鑒定結(jié)果(與傳統(tǒng)生化方法的屬水平的一致率是98.9%)，并且這種方法不會(huì)受血培養(yǎng)系統(tǒng)的影響，成本低，易于操作。

3.與藥物敏感性聯(lián)合檢測(cè)為了克服MALDI-TOF MS不能做體外藥物敏感性試驗(yàn)的不足，MALDI-TOF MS已經(jīng)開始與藥物敏感性試驗(yàn)聯(lián)合用來直接檢測(cè)陽性血培養(yǎng)瓶的樣本[26]，用不含活性炭的血培養(yǎng)基在過濾和洗滌之前用溶解細(xì)胞的緩沖液進(jìn)行孵育，然后將從過濾膜上收集的微生物直接進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，剩下的樣本用VITEK 2系統(tǒng)孵育并進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，將94.0%的樣本鑒定到了種的水平，藥物敏感性試驗(yàn)與傳統(tǒng)方法相比有93.5%的一致率，并且相較于傳統(tǒng)的56.3 h，新方法鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)所用的時(shí)間縮短到了11.4 h。證明了在一天內(nèi)完成微生物鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)的可行性。為獲得更好的治療爭(zhēng)取了時(shí)間并且減少了住院的費(fèi)用[27]。

4.檢測(cè)結(jié)果的影響因素有研究指出不同的血培養(yǎng)瓶和血培養(yǎng)系統(tǒng)可能會(huì)產(chǎn)生鑒定結(jié)果的差異[19，28-29]:使用含有活性炭的血培養(yǎng)瓶和BacT/ ALERT血培養(yǎng)系統(tǒng)的鑒定率較低，使用含有樹脂的血培養(yǎng)瓶和BACTECTM血培養(yǎng)系統(tǒng)鑒定率較高。其中一項(xiàng)研究比較了含有活性炭的和不含活性炭的血培養(yǎng)瓶在BacT/ALERT血培養(yǎng)系統(tǒng)下的鑒定表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)使用不含活性炭的血培養(yǎng)瓶的MALDI-TOF MS的鑒定率為30%，而含有活性炭的血培養(yǎng)瓶的鑒定率只有8%[28]。而另一項(xiàng)研究比較了3種不同的血培養(yǎng)系統(tǒng)——BACTECTM，VERSATREK和BacT/ALERT對(duì)鑒定率的影響，經(jīng)這些鑒定系統(tǒng)培養(yǎng)的陽性血培養(yǎng)瓶的鑒定成功率分別是76%、69%和62%[29]。此外，使用不同的細(xì)菌蛋白提取程序也會(huì)影響鑒定成功率[11]。

(二)泌尿系統(tǒng)感染病原菌的快速檢測(cè)

因泌尿系統(tǒng)感染的中段尿樣本中的細(xì)菌量相對(duì)很高，中段尿樣本也是MALDI-TOF MS直接檢測(cè)的理想選擇[30]，并且常常是單一菌種感染，避免了MALDI-TOF MS在鑒定混合菌樣本的不足[31]。泌尿系統(tǒng)感染是人類常見的感染性疾病，臨床泌尿系統(tǒng)感染最常見的病原菌為大腸埃希菌(70%～95%)、腐生葡萄球菌(5%～10%)以及其它腸桿菌科細(xì)菌，如奇異變形桿菌和肺炎克雷伯菌。有研究表明MALDI-TOF MS對(duì)尿液樣本中這些細(xì)菌的鑒定效率和準(zhǔn)確率要優(yōu)于傳統(tǒng)鑒定方法和其他鑒定系統(tǒng)[7，32-33]。

1.鑒定效能FERREIRA等[7]選取尿液中細(xì)菌大于1×105cfu/mL的樣本進(jìn)行直接的MALDITOF MS鑒定，結(jié)果顯示尿液樣本經(jīng)過差速離心法處理后，可將91.8%的菌株鑒定到種、92.7%的菌株鑒定到屬的水平。

楊溪等[33]使用MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)臨床收集到的1 040份尿液樣本進(jìn)行直接快速檢測(cè)，共鑒定出含細(xì)菌的樣本526份，其中尿細(xì)菌培養(yǎng)菌落數(shù)≥1×105cfu/mL，培養(yǎng)出1種/2種菌的尿液樣本MALDI-TOF MS的直接鑒定率分別為92.7%(430/464)和75%(96/128)。MALDI-TOF MS直接檢測(cè)法的鑒定結(jié)果與尿細(xì)菌培養(yǎng)法鑒定出的細(xì)菌菌種一致，符合率為100%。

2.與流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)用懷疑泌尿系統(tǒng)感染的尿液樣本一般經(jīng)離心后取沉淀直接進(jìn)行檢測(cè)，但考慮到臨床上有60%～80%的尿液樣本是陰性的，為了減少分析的時(shí)間和人工的工作量，有學(xué)者將MALDI-TOF MS與流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)用檢測(cè)，用流式細(xì)胞術(shù)篩除細(xì)菌數(shù)量不足的尿液樣本，而MALDI-TOF MS用來檢測(cè)篩選結(jié)果為陽性的尿液樣本，取得了良好的鑒定效果[34-35]。MARCH ROSSELLó等[34]建立了這樣一種微生物鑒定程序:先用流式細(xì)胞儀進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)篩查出單一細(xì)菌陽性的尿液樣本，然后再進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌數(shù)在1×107cfu/mL時(shí)是足夠的細(xì)菌濃度，有87.5%的敏感性，而細(xì)菌數(shù)在(1× 105)～(1×107)cfu/mL之間的樣本經(jīng)過4 h的預(yù)增菌，得到用于分析的足夠的細(xì)菌數(shù)量后，可以達(dá)到91.7%的敏感性。

3.細(xì)菌含量對(duì)鑒定結(jié)果的影響由于中段尿中病原菌數(shù)＜1×105cfu/mL時(shí)也有可能預(yù)示著尿路感染，ROSSELLó等[12]研究了不同細(xì)菌濃度對(duì)直接鑒定準(zhǔn)確率的影響，結(jié)果表明大多數(shù)情況下細(xì)菌數(shù)≥1×105cfu/mL的樣本能產(chǎn)生更高的鑒定分?jǐn)?shù)(接近或＞2.0)，而隨著樣本中細(xì)菌數(shù)的降低，鑒定成功的比例和鑒定分?jǐn)?shù)也在下降，當(dāng)菌落數(shù)＜1×104cfu/mL時(shí)，不能得到可靠的鑒定結(jié)果;并且發(fā)現(xiàn)在每一個(gè)細(xì)菌濃度下，腸桿菌科的細(xì)菌均顯示了更高的鑒定分?jǐn)?shù)和鑒定準(zhǔn)確率;革蘭陰性菌的鑒定分?jǐn)?shù)和鑒定成功率要比革蘭陽性菌高，這與在血樣本直接鑒定得到的結(jié)果一致;對(duì)于4株酵母菌樣本，2個(gè)菌落數(shù)≥1×105cfu/mL的樣本能被準(zhǔn)確鑒定，而菌落數(shù)在(1×104)～(5 ×104)cfu/mL時(shí)則不能鑒定。而王琳等[36]的研究發(fā)現(xiàn)，單一菌感染且細(xì)菌數(shù)＞1×104cfu/mL的中段尿樣本，應(yīng)用MALDI-TOF MS直接檢測(cè)即可取得滿意的鑒定效果。

4.中段尿樣本直接檢測(cè)的新方法DEMARCO等[31]近期描述了一種透析過濾的方法，通過脫鹽、分餾、富集等步驟對(duì)100例陽性尿液樣本在MALDI-TOF MS分析前進(jìn)行了預(yù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種預(yù)處理方法能夠正確地鑒定陽性尿液樣本，并且正確分類了所有臨床相關(guān)菌尿癥的陰性尿液樣本，包括一組污染的尿液樣本和一組臨床上無關(guān)緊要的定植菌。敏感性和特異性分別是67%和100%。

5.中段尿樣本直接檢測(cè)的不足之處與直接檢測(cè)培養(yǎng)陽性的血樣本一樣，對(duì)于含有2種或2種以上細(xì)菌感染的中段尿樣本，MALDI-TOF MS常常表現(xiàn)為鑒定能力不足[33，35];尿液蛋白質(zhì)如α-防御素[8]會(huì)造成鑒定結(jié)果不能正確匹配數(shù)據(jù)庫;對(duì)酵母菌的鑒定能力也有待于進(jìn)一步提高;對(duì)于核糖體蛋白序列差異很小的菌種也常常不能區(qū)分。

(三)其它無菌體液

MALDI-TOF MS直接檢測(cè)和鑒定其它無菌體液樣本如腦脊液、胸腹水和關(guān)節(jié)液等中細(xì)菌的報(bào)道尚不多。NYVANG HARTMEYER等[37]首次報(bào)道了通過直接將腦脊液樣本離心取上清直接進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，肺炎鏈球菌性腦膜炎可以在30 min內(nèi)做出診斷，為后續(xù)治療方案的選擇和結(jié)果的解釋提供了重要的參考依據(jù)。SEGAWA等[38]也用同樣的方法對(duì)一例肺炎克雷伯菌引起的腦膜炎做出了診斷，但同時(shí)也指出在實(shí)際應(yīng)用中能獲得的樣本量少，細(xì)菌數(shù)少可能會(huì)限制它的應(yīng)用。另外，還可將無菌體液樣本轉(zhuǎn)移到血培養(yǎng)瓶中進(jìn)行孵育，待報(bào)陽后進(jìn)行檢測(cè)也是可行的。有研究應(yīng)用MALDI-TOF MS檢測(cè)了46份液體，包括移植養(yǎng)護(hù)液、關(guān)節(jié)液、深部膿皰樣本、骨小孔樣本用血培養(yǎng)基孵育，發(fā)現(xiàn)44/46(96%)能鑒定到種的水平，余下的2份被鑒定到屬的水平[18]。

四、總結(jié)與展望

MALDI-TOF MS是一種簡(jiǎn)單、快速、高通量和高效的微生物鑒定手段，在臨床樣本直接檢測(cè)方面較傳統(tǒng)的鑒定方法具有更大的優(yōu)勢(shì)，能顯著降低樣本檢測(cè)的周轉(zhuǎn)時(shí)間和成本，但尚存在著一些不足之處，主要表現(xiàn)在:(1)MALDI-TOF MS在檢測(cè)和鑒定細(xì)菌方面的敏感性還不高，不能直接鑒定患者血樣本中的病原菌(細(xì)菌數(shù)量太少);(2)對(duì)于一些核糖體蛋白差異較小的細(xì)菌用其辨別有較大的困難;(3)目前的研究都有各自不同的操作過程，在樣本處理、質(zhì)譜圖采集和分析等方面沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，可能會(huì)影響分析結(jié)果在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間的可重復(fù)性;(4)標(biāo)準(zhǔn)的鑒定參考圖譜數(shù)據(jù)庫尚不夠完善，需要進(jìn)一步拓展;(5)對(duì)一些細(xì)胞壁難以破壞的細(xì)菌(如革蘭陽性菌、酵母菌)和混合菌等的鑒定能力還不夠高。但是相信隨著更加有效的樣本預(yù)處理方法、更加嚴(yán)格的檢測(cè)過程控制和更高分辨率的圖像處理技術(shù)的實(shí)現(xiàn)，MALDI-TOF MS用于直接檢測(cè)臨床樣本中的微生物會(huì)有更廣闊的前景。

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Application of MALDI-TOF MS in direct identification of clinical microbiological samples

CHEN Fei，HU Binjie，ZHAO Hu.(Department of Clinical Laboratory，Huadong Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200040，China)

Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)，as a newly developed technology in recent years，is an easy，rapid，accurate and cost-effective method for microbial identification in clinical microbiology，compared to conventional phenotypic techniques or molecular biology.Given the accuracy and reliability of MALDI-TOF MS in the identification of microorganisms grown on solid medium，this technology might also be directly applied to some clinical microbiological samples，such as positive blood culture bottles，midstream urine，cerebrospinal fluid and so on.The goal of this review was to discuss the application of MALDI-TOF MS technology in direct identification of clinical microbiological samples，including the principles，protocols，performance and research progress.

Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry;Direct identification; Microbial identification;Clinical sample

1673-8640(2015)07-0750-07

R446.5

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.07.019

2014-12-05)

(本文編輯:姜敏)

陳飛，男，1991年生，碩士，主要從事臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)研究。

趙虎，聯(lián)系電話:021-62483180。