劉 然， 郭春梅， 劉佃香， 李玉梅

(大慶市第二醫(yī)院檢驗科，黑龍江大慶1634610)

在防治肺結(jié)核的工作中，由于患者不規(guī)范治療的原因，造成耐藥肺結(jié)核的問題非常嚴(yán)重。中國耐多藥結(jié)核病疫情居高不下，耐藥性結(jié)核病的產(chǎn)生在很大的程度上影響了結(jié)核病治療的療效，尤其耐多藥結(jié)核病(multidrug resistance tuberculosis，MDRTB)已成為當(dāng)前結(jié)核病防治中的一個難題［1］，也是結(jié)核病患者死亡的最大殺手，所以早期能夠及時、快速地對結(jié)核病耐藥性進行檢測，讓患者得到科學(xué)治療十分重要。目前肺結(jié)核耐藥性主要靠細(xì)菌學(xué)檢查(包括細(xì)菌培養(yǎng)、菌種鑒定與藥物敏感試驗)，由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，整個培養(yǎng)、菌種鑒定加上藥物敏感試驗時間最快也要2個月，不能有效指導(dǎo)臨床治療同時也加大了病原菌傳播機會。由此可見，尋找快速的檢測方法意義重大。我們采用線性探針法用于快速篩查耐多藥肺結(jié)核，只需要2 d時間［2］，就可以檢測出利福平和異煙肼耐藥的涂片陽性肺結(jié)核患者。

一、材料和方法

1.標(biāo)本來源 大慶市第二醫(yī)院2014年5月至2014年12月收治的明確診斷為肺結(jié)核住院患者。結(jié)核分枝桿菌涂片陽性標(biāo)本86份;結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)陽性30份。

2.主要儀器與試劑 珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的改良L-J培養(yǎng)基及含藥培養(yǎng)基;HAIN結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測系統(tǒng)［3］;GenoType MTBDRplus試劑盒購自德國Hain公司。

3.傳統(tǒng)藥敏試驗 用傳統(tǒng)改良L-J培養(yǎng)基檢測對利福平、異煙肼等抗結(jié)核藥物的敏感性。使用藥物最終濃度分別為利福平40.0μg/mL、異煙肼0.2μg/mL。按照全國臨床檢驗操作規(guī)程操作要求用接種環(huán)刮取改良L-J培養(yǎng)基表面的菌落，以0.5%Tween 80生理鹽水磨菌配成1 mg/mL的菌液，進行100倍稀釋。混勻后取菌液0.1mL，均勻地接種于培養(yǎng)基斜面上，每1種藥物接種2支培養(yǎng)基，同時接種0.1mL于不含藥的培養(yǎng)基，每周觀察1次，至4周報告結(jié)果。

4.線性探針法檢測 (1)對涂片陽性標(biāo)本的檢測:使用堿處理-中和離心沉淀法對痰標(biāo)本進行前消化處理。0.1mL接種改良L-J培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)。取經(jīng)前消化處理后的痰標(biāo)本按照分子線性探針雜交，嚴(yán)格按照GenoType MTBDR說明書要求操作，檢測流程包括目的基因片段的擴增、反向雜交膜顯色(使用GenoTypeHot40專用程序)、結(jié)果判讀;(2)對陽性培養(yǎng)物檢測:將從羅氏培養(yǎng)基上刮取一接種環(huán)結(jié)核分枝桿菌混勻于裝有200μL雙蒸水的1.5 mL離心管中，95℃金屬浴滅活30 min。用基因提取試劑盒提取結(jié)核分枝桿菌核酸，再進行基因片段的擴增、反向雜交膜顯色(使用GenoTypeHot30專用程序)、結(jié)果判讀。

5.判讀標(biāo)準(zhǔn)(參照試劑盒說明書)(1)肉眼觀察雜交條帶顯色情況，只有那些與擴增指控帶(AC)強度相同或更強的條帶才可判斷為陽性;條帶上的標(biāo)記物質(zhì)控(CC)、AC、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及位點質(zhì)控(rpoB、KatG、inhA)需全部陽性，結(jié)果方可進行判讀，否則為無效結(jié)果;(2)野生型探針:所有野生型探針條帶陽性，表示檢測區(qū)沒有發(fā)生可檢出的突變，試驗菌株對各自抗菌藥物敏感;如果至少有1個野生型探針信號缺失，則表示試驗菌株對相應(yīng)的抗菌藥物耐藥;如果rpoB野生型探針信號缺失，則可得出試驗菌株對利福平耐藥的結(jié)論;如果KatG野生型探針缺失，則可得出試驗菌株對高水平異煙肼耐藥的結(jié)論，如果inhA野生型探針缺失，則可得出試驗菌株對低水平異煙肼耐藥性的結(jié)論;(3)突變探針:如果rpoB突變型探針信號陽性，則可得出試驗菌株對利福平耐藥的結(jié)論;如果KatG突變型探針信號陽性，則可得出試驗菌株對高水平異煙肼耐藥的結(jié)論，如果inhA突變型探針信號陽性，則可得出試驗菌株對低水平異煙肼耐藥性的結(jié)論。

二、結(jié)果

1.對86份結(jié)核分枝桿菌涂片陽性標(biāo)本進行分析。結(jié)果顯示利福平單耐藥2種方法的符合率為95.6%，見表1。

表1 86份結(jié)核分枝桿菌涂片陽性標(biāo)本分析

2.采用傳統(tǒng)藥敏試驗和線性探針法同時對30份結(jié)核分枝桿菌陽性培養(yǎng)物進行分析。結(jié)果顯示利福平單耐藥、異煙肼單耐藥及二者同時耐藥的符合率均為100%。見表2。

表2 30份結(jié)核分枝桿菌陽性培養(yǎng)物分析

3.對86份結(jié)核分枝桿菌涂片陽性標(biāo)本分別采用傳統(tǒng)培養(yǎng)和線性探針方法檢測分析。發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)核分枝桿菌陽性84份，陽性符合率97.6%，而用線性探針法則結(jié)核分枝桿菌陽性86份，陽性符合率達(dá)100%。

4.對30份結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性物進行線性探針方法檢測，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群均為陽性，符合率為100%(30/30)。

三、討論

線性探針法的主要原理是在標(biāo)本中提取核酸DNA、用生物素標(biāo)記的引物進行多重聚合酶鏈反應(yīng)擴增和反向雜交。通過檢測RPOB基因突變(編碼還原型輔酶Ⅰ聚合酶B-亞單位)確定對利福平的耐藥性［4］;通過檢測KATG基因(編碼過氧化氫酶)和INHA基因的啟動子區(qū)(編碼NADH烯酰酸性磷酸酶還原酶)確定對異煙肼的耐藥性［5-6］。

傳統(tǒng)藥敏試驗是檢測藥物耐藥性的金標(biāo)準(zhǔn)，但檢測時間太長。通過對線性探針法、傳統(tǒng)藥敏法檢測利福平和異煙肼耐藥符合性的研究，耐藥結(jié)果符合率達(dá)到了100%。線性探針法快速篩查耐多藥肺結(jié)核，只需要2 d時間。本研究結(jié)果顯示，對結(jié)核桿菌涂片陽性標(biāo)本直接采用線性探針方法篩查耐多藥肺結(jié)核，既快速又準(zhǔn)確，能快速為臨床提供耐多藥肺結(jié)核的耐藥檢測結(jié)果，讓患者得到及時科學(xué)治療，臨床意義重大。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部.全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報告(2007-2008)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:1-3.

［2］單萬水，單金嵐，詹能勇，等.DNA芯片快速檢測耐利福平結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2003，26(11):680-682.

［3］中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室.線性探針耐藥性檢測方法應(yīng)用評估實施細(xì)則［S］.北京:中國疾病預(yù)防控制中心，2010:37-47.

［4］MILLER LP，CRAWFORD JT，SHINNICK TM.The rpoB gene of Mycobacterium tuloercubsis［J］.Antimicrob Agents Chemother，1994，38(4):805-811.

［5］MANI C，SELVAKUMAR N，NARAYANAN S，etal.Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from India［J］.JClin Microbiol，2001，39(8):2987-2990.

［6］VILCHèZE C，WEISBROD TR，CHEN B，etal.Altered NADH/NAD+ratio mediates coresistance to isoniazid and ethionamide in mycobacteria［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49(2):708-720.