楊婷婷， 王 青， 李 志， 樸 君， 樸敬愛

(1.大連市中心醫(yī)院檢驗科，遼寧大連116033;2.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116033)

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，主要表現(xiàn)為表皮角質(zhì)細(xì)胞過度增生和炎癥細(xì)胞浸潤，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，現(xiàn)常用外用藥物或光線療法控制其病情的發(fā)展，但不能根治且易復(fù)發(fā)，有關(guān)專家表示未來的治療模式應(yīng)為藥物阻斷致病過程中導(dǎo)致銀屑病斑塊形成的過程，這就迫切需要找到其發(fā)病的根本機(jī)制［1］。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制現(xiàn)認(rèn)為CD4+T淋巴細(xì)胞免疫功能異常發(fā)揮著重要作用。以前研究證實(shí)銀屑病發(fā)病中存在輔助性T細(xì)胞1(T helper cell 1，Th1)和Th2細(xì)胞平衡失調(diào)，且以Th1型反應(yīng)為主。此后發(fā)現(xiàn)，除了Th1和Th2細(xì)胞，T細(xì)胞亞群的另兩位成員輔助性T細(xì)胞 17(T helper cell 17，Th17)和調(diào)節(jié)性 T(regulatory T，Treg)細(xì)胞在各類自身免疫性及炎癥性疾病中均發(fā)揮重要作用［2-4］。此外，最近研究顯示Th17和Treg細(xì)胞的分化與機(jī)體的生理狀態(tài)密切相關(guān)，此過程可能成為自身免疫性疾病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［5］。本研究從細(xì)胞、mRNA和蛋白3種不同水平對銀屑病患者外周血Th17/Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子進(jìn)行動態(tài)檢測，以期進(jìn)一步了解Th17/Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子與銀屑病之間的相互關(guān)系。

材料和方法

一、研究對象

選取2013年3月至2014年1月在大連市中心醫(yī)院門診就診的銀屑病患者53例，男33例，女20例，年齡24～71歲，平均年齡39.5歲，病程1個月～7年不等。所有患者符合銀屑病的診斷標(biāo)準(zhǔn):具有典型的紅斑、銀白色鱗屑等皮疹，均經(jīng)臨床與組織病理檢查確診。其中銀屑病患者輕度28例［1＜銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(psoriasis area and severity index，PASI score)≤25］，重度25例(PASI score＞25)。所有患者1個月內(nèi)未使用皮質(zhì)類固醇激素和免疫抑制劑。排除其他嚴(yán)重疾病、其他皮膚病及自身免疫性疾病。另選取健康對照組25名，為大連市中心醫(yī)院健康體檢者，無免疫性及系統(tǒng)性疾病，無銀屑病家族史和其他皮膚病。健康對照組與患者組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

二、儀器與試劑

異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記-抗人CD3單克隆抗體、FITC標(biāo)記-抗人 CD4單克隆抗體、藻紅蛋白花青素 5.1(phycoerythrin green pigment 5.1，PC5)標(biāo)記-抗人CD4單克隆抗體、PC5標(biāo)記-抗人CD25單克隆抗體及固定破膜劑為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品，藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記-抗人白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)單克隆抗體及同型、PE標(biāo)記-抗人叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box P3，F(xiàn)oxp3)單克隆抗體及同型為美國eBioscience公司產(chǎn)品，12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、離子霉素和莫能霉素為美國Sigma公司產(chǎn)品，RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0為大連寶生物有限公司產(chǎn)品，人 IL-17酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)定量測定試劑盒為北京博凌科為生物科技有限公司產(chǎn)品，人轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor beta ，TGF-β)ELISA 定量測定試劑盒為R＆D公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀EPICS XL為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品，引物由大連寶生物有限公司合成。

三、樣本采集和處理

受檢者清晨空腹靜脈采血，置于肝素鈉抗凝管中用于Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的流式檢測;置于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管中用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR);置于非抗凝管中用于IL-17和TGF-β定量測定。

四、方法

1.流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞密度梯度離心法(Ficoll)分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，將分離出的外周血PBMC加入CD3和CD4的熒光標(biāo)記抗體溫育30 min，用于Th17細(xì)胞的表面標(biāo)記，溫育后的樣本用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，并加入到特殊培養(yǎng)液中(含10%新生牛血清、100 IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、50 ng/mL PMA、離子霉素1μg/mL、莫能霉素3 mmol/L)，置于37℃溫箱溫育18～20 h(特殊培養(yǎng)液各組分濃度和細(xì)胞培養(yǎng)時間等參考試劑廠家提供的數(shù)據(jù)，并經(jīng)數(shù)次預(yù)實(shí)驗結(jié)果確定)。培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行固定破膜(按照說明書操作)，之后加入熒光標(biāo)記IL-17抗體和對照抗體，溫育30 min后待測。取外周全血200μL加入CD4和CD25的熒光標(biāo)記抗體溫育20 min，然后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌樣本后進(jìn)行固定破膜(按說明書操作)，最后加入熒光標(biāo)記Foxp3單克隆抗體和對照抗體，溫育30 min。流式細(xì)胞儀測定標(biāo)記的2種細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，界定CD3+CD4+CD17+為Th17細(xì)胞，CD4+CD25highFoxp3+為Treg細(xì)胞。

2.逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(retinoid-related orphan receptor gamma t，RORγt)和Foxp3 mRNA的表達(dá) Trizol法提取RNA后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按以下條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):30℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，5 ℃5 min。然后PCR擴(kuò)增目標(biāo)DNA，35個循環(huán)結(jié)束后，取5μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳(50 mV，20 mA，30 min)，產(chǎn)物用凝膠成像系統(tǒng)掃描，檢測基因與內(nèi)參照條帶灰度值的比值表示該基因mRNA的表達(dá)水平。以β-actin mRNA表達(dá)量為內(nèi)參照，引物序列由大連寶生物有限公司設(shè)計和合成，F(xiàn)oxp3上游引物:5'-CACCCAGGAAAGACAGCAACC-3';下游引物:5'-GCAAGAGCTCTTGTCCATTGA-3'。RORγt上游引物:5'-ACCTCCACTGCCAGCTGTGTGCTGTC-3';下游引物:5'-TCATTTCTGCACTTCTGCATGTAGACTGTCCC-3'。β-actin 上 游 引物:5'-TCA-TGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3';下游引物:5'-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG-3'。

3.ELISA檢測IL-17和TGF-β濃度 按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞因子IL-17和TGF-β的測定。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例

與健康對照組比較，輕度和重度銀屑病患者外周血Th17細(xì)胞比例顯著升高(P＜0.05)，且輕度組和重度組間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與健康對照組比較，重度銀屑病患者外周血Treg細(xì)胞比例顯著降低(P＜0.05)，輕度組與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖1、圖2。

二、各組外周血Foxp3、RORγt mRNA的表達(dá)

與健康對照組比較，銀屑病患者外周血RORγt mRNA的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，且輕度組和重度組間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與健康對照組和輕度銀屑病患者比較，重度銀屑病患者Foxp3 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，輕度組與健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1、圖3。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的表達(dá)

圖2 各組外周血中Th17和Treg細(xì)胞所占比例

表1 各組外周血中Foxp3和RORγt mRNA的表達(dá)

圖3 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測Foxp3、RORγt mRNA的表達(dá)

三、各組外周血IL-17、TGF-β的水平

與健康對照組比較，銀屑病患者血漿IL-17的水平均顯著升高(P＜0.05)，且輕度組和重度組間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與健康對照組和輕度銀屑病患者比較，重度銀屑病患者體內(nèi)TGF-β水平明顯降低(P＜0.05)，而輕度組與健康對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 各組外周血中IL-17、TGF-β的水平比較

討 論

T細(xì)胞功能異常是維持銀屑病疾病活動性的中心環(huán)節(jié)，與皮損的發(fā)生、發(fā)展和持續(xù)密切相關(guān)。本實(shí)驗聯(lián)合了流式細(xì)胞術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄PCR及酶聯(lián)免疫定量技術(shù)對銀屑病疾病組和健康對照組Th17、Treg細(xì)胞及其轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子水平進(jìn)行了反復(fù)檢測，從細(xì)胞水平、轉(zhuǎn)錄因子水平及蛋白水平對銀屑病患者外周血中2種細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行研究。

本研究結(jié)果顯示，隨著銀屑病患者疾病嚴(yán)重程度的加深，外周血Th17細(xì)胞所占的比例及其特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt的mRNA表達(dá)水平及血漿中IL-17的表達(dá)水平均明顯上調(diào)，與國內(nèi)外現(xiàn)有的大多數(shù)研究結(jié)果相一致［6］。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損真皮淺層IL-17陽性單一核細(xì)胞數(shù)顯著增加［7］。此外，有學(xué)者指出炎癥性樹突狀細(xì)胞釋放IL-23和IL-12激活產(chǎn)生IL-17的T細(xì)胞，Th1細(xì)胞和Th22細(xì)胞產(chǎn)生大量的銀屑病細(xì)胞因子IL-17、γ 干擾素(interferon gamma，IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和 IL-22，這些細(xì)胞因子介導(dǎo)產(chǎn)生角質(zhì)形成細(xì)胞放大了銀屑病的炎癥反應(yīng)［8］。以上結(jié)果充分說明了Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-23及TNF在銀屑病發(fā)病過程中的重要性。本實(shí)驗結(jié)果說明隨著疾病嚴(yán)重程度的加深，其表達(dá)也隨之增加，推測其可能參與中性粒細(xì)胞增生、成熟和趨化，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移到銀屑病皮損處，加重炎癥反應(yīng)。EKMAN等［9］通過實(shí)驗證實(shí)銀屑病患者在接受紫外線照射治療后IL-17水平明顯下降，趨近于正常對照組的水平，提示靶向阻斷Th17/IL-17通路可能阻止疾病的發(fā)生和發(fā)展。

CD4+CD25highFoxp3+細(xì)胞是一種免疫性抑制細(xì)胞，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、誘導(dǎo)移植耐受及自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究顯示，重度銀屑病患者外周血CD4+CD25highFoxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)顯著低于健康對照組(P＜0.05)，而輕度組與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。但是由于Treg細(xì)胞在外周血中的數(shù)量較少，我們又比較了各組Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA及細(xì)胞因子TGF-β的表達(dá)，結(jié)果顯示重度銀屑病患者Foxp3 mRNA的表達(dá)和TGF-β的濃度顯著低于輕度組和健康對照組，與流式檢測的結(jié)果一致，說明銀屑病患者體內(nèi)可能存在Treg細(xì)胞數(shù)量的減少以及免疫調(diào)節(jié)功能的缺失。以上結(jié)果可以證實(shí)無論是Treg細(xì)胞數(shù)量還是功能顯著降低，不足以抑制效應(yīng)淋巴細(xì)胞的增殖及免疫效應(yīng)功能，導(dǎo)致炎癥性細(xì)胞的過度分化。另一方面Treg細(xì)胞由于所處細(xì)胞環(huán)境的變化可能轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞，使其免疫抑制功能減弱而導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞過度增殖，促進(jìn)炎癥的發(fā)展［5，10］。然而在這一領(lǐng)域相關(guān)的研究亦有不同的結(jié)論，YAN等［11］研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮損區(qū)CD4+CD25highFoxp3+Treg細(xì)胞的數(shù)量要高于健康對照組，且與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系。出現(xiàn)以上不同的結(jié)果可能與所選取的研究對象所處的病程及取材的部位不同有關(guān)。由此可見Treg細(xì)胞及相關(guān)因子在銀屑病患者體內(nèi)的行為尚存在爭議，還需要大量的實(shí)驗進(jìn)一步確定Treg細(xì)胞在患者體內(nèi)的表達(dá)。

在不同的細(xì)胞因子環(huán)境中通過不同的信號途徑對初始CD4+T細(xì)胞向Treg或Th17細(xì)胞的分化進(jìn)行調(diào)節(jié)。Treg和Th17細(xì)胞的分化緊密聯(lián)系，低劑量TGF-β聯(lián)合IL-21或IL-1、IL-6可誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向Th17分化;高劑量TGF-β和在缺少炎癥因子的情況下，TGF-β就會轉(zhuǎn)而抑制Th17的分化，促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，可以看出Treg和Th17細(xì)胞在分化及功能上是相互拮抗的。本研究結(jié)果顯示，銀屑病患者血漿中Th17細(xì)胞顯著升高且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，而重度患者Treg細(xì)胞明顯減少，說明Th17細(xì)胞的過度分化、Treg細(xì)胞的數(shù)量減少及功能受損導(dǎo)致的Th17/Treg平衡失調(diào)可能是銀屑病發(fā)病的重要原因。此外，在促炎條件下，Treg細(xì)胞能分化成Th17細(xì)胞，重度銀屑病患者Treg細(xì)胞分化功能的增強(qiáng)源于RORγt表達(dá)的增多和Foxp3表達(dá)的減少，RORγt和Foxp3兩者的平衡或許是決定2種細(xì)胞分化方向的關(guān)鍵［12］。

綜上所述，在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展過程中，可以通過Th17和Treg細(xì)胞失衡來解釋部分發(fā)病機(jī)制，但是銀屑病Th17細(xì)胞的招募、增殖及與Treg細(xì)胞之間的分化和轉(zhuǎn)化的基本機(jī)制有待進(jìn)一步研究，以期為銀屑病發(fā)病機(jī)制的探討及臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

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