胡亮，陳藝，陳長強，瞿晨蕓，顧志冬，樊綺詩

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院檢驗科，上海201801; 2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海200025)

乳膠顆粒凝集法檢測梅毒特異性抗體的性能評估

胡亮1，陳藝1，陳長強1，瞿晨蕓1，顧志冬2，樊綺詩1

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院檢驗科，上海201801; 2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海200025)

目的對乳膠顆粒凝集法梅毒螺旋體特異性抗體檢測試劑(Mediace TPLA)進行性能評估。方法參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)EP系列文件，評估Mediace TPLA的分析性能。用Mediace TPLA檢測111例梅毒確診患者和78例排除梅毒感染者的血清，并與化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法(CMIA)進行比較。結(jié)果Mediace TPLA檢測結(jié)果在8.0、28.6及166.0 T.U.這3個水平的總變異系數(shù)(CV)分別為8.77%、3.94%和6.57%;檢測線性范圍為0～250 T.U.;總回收率為95.31%;一定程度的溶血(血紅蛋白＜4.8 g/L)、脂血(甘油三酯＜8 mmol/L)、黃疸(膽紅素＜20 μmol/L)及類風(fēng)濕因子(＜450 IU/mL)對檢測結(jié)果無明顯影響;排除梅毒感染的30例抗核抗體(ANA)陽性患者、10例肝炎患者及10例妊娠期婦女血清檢測結(jié)果為陰性。以CMIA結(jié)果為相對標(biāo)準(zhǔn)，Mediace TPLA Cut－off值取10 T.U.時，其檢測靈敏度為99%、特異性為100%。結(jié)論Mediace TPLA具有抗干擾能力強、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性好、線性范圍寬及特異度高等特點，可在全自動生化分析儀中使用。

梅毒;乳膠顆粒凝集法;血清學(xué)檢測

梅毒(syphilis)是由梅毒螺旋體感染人體所引起的一種常見的性傳播疾病。其特點為病程長，病變可以侵蝕皮膚黏膜及全身各個組織器官，臨床表現(xiàn)多種多樣，婦女感染后如不治療可垂直傳染給下一代[1]。近年來，梅毒發(fā)病率呈上升趨勢。根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心發(fā)布的《2012年度全國法定傳染病疫情概況》的數(shù)據(jù)，2012年我國梅毒發(fā)病人數(shù)逾40萬，居乙類傳染病第3位。梅毒已是臨床輸血前、術(shù)前及孕前等篩查的基本項目之一。傳統(tǒng)的梅毒螺旋體檢測方法有快速血漿反應(yīng)素試驗(syphilis rapid plasma reagin，RPR)、甲苯胺紅不加熱血清反應(yīng)素試驗(tolulized red unheated serum test，TRUST)、熒光密螺旋體抗體吸收試驗(fluorescentTreponemalantibody absorption，F(xiàn)TA－ABS)、梅毒螺旋體明膠凝集試驗(Treponema pallidum particle agglutination，TPPA)、梅毒螺旋體血凝試驗(treponema pallidum hemagglutination assay，TPHA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)和膠體金法等，這些方法由于沒有實現(xiàn)自動化、操作繁瑣，已不能滿足臨床實驗室快速、準(zhǔn)確檢測的要求。近年來，以化學(xué)發(fā)光為原理的梅毒螺旋體抗體檢測方法正逐步應(yīng)用于臨床，但需配套設(shè)備，只能在有條件的實驗室開展。

乳膠顆粒凝集法梅毒螺旋體特異性抗體檢測試劑(mediace triponema pallidum latex agglutination，Mediace TPLA)是一種較新的、可開放用于不同檢測系統(tǒng)的梅毒血清學(xué)檢測試劑。為了評估該試劑的臨床適用性，我們參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)EP系列文件，對其進行性能評估，并與化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法(chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA)進行比較，為臨床實驗室選擇梅毒自動化檢測方法提供參考。

材料和方法

一、材料

收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院、瑞金醫(yī)院北院檢驗科2012年12月至2013年9月的梅毒陽性血清111例、陰性血清78例，排除梅毒感染的ANA陽性患者血清30例、肝炎患者血清10例及妊娠期婦女血清10例。梅毒的診斷主要依靠實驗室血清學(xué)檢查，本研究中梅毒陽性血清的判斷標(biāo)準(zhǔn)為TPPA及CMIA檢測結(jié)果同時陽性，梅毒陰性或排除梅毒感染血清的判斷標(biāo)準(zhǔn)為RPR、TRUST、TPPA及CMIA檢測結(jié)果均為陰性。所有對象采用真空管采集靜脈血，2 100×g離心5 min，分離血清后于－20℃保存待用。

二、方法

1.Mediace TPLA采用乳膠顆粒凝集法進行檢測，試劑及配套定標(biāo)品、質(zhì)控品由日本積水醫(yī)療株式會社生產(chǎn)，儀器為BECKMAN－COULTER AU5800全自動生化分析儀。按試劑說明書設(shè)置該項目的參數(shù)，血清9 μL、第1試劑(R1)105 μL、第2試劑(R2)15 μL、測定波長700 nm。

2.梅毒抗體(TP－Ab)的檢測采用CMIA測定血清中的梅毒螺旋體特異性抗體，試劑及標(biāo)準(zhǔn)品為美國雅培公司產(chǎn)品，使用上海市臨床檢驗中心梅毒特異性抗體質(zhì)控品，儀器為雅培Architect i2000化學(xué)發(fā)光分析儀。嚴(yán)格按試劑說明書及儀器操作手冊進行試驗。

3.精密度試驗根據(jù)CLSI EP5－A2文件[2]，選擇低、中、高3個濃度水平的標(biāo)本，每天上、下午分2批實驗，每批做雙份檢測，連續(xù)檢測20 d，一共有240個數(shù)據(jù)。計算出批內(nèi)不精密度的標(biāo)準(zhǔn)差(s批內(nèi))、批間不精密度的標(biāo)準(zhǔn)差(s批間)、天間不精密度的標(biāo)準(zhǔn)差(s天間)，最后按照方差和的方式將批內(nèi)、批間和天間標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)合起來求出總標(biāo)準(zhǔn)差(s總)，計算出總變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)。

4.干擾試驗計算加入干擾物質(zhì)后的實測值，共重復(fù)檢測4次，取平均值，與預(yù)期值比較，得到回收率。

5.分析測量范圍根據(jù)CLSI EP6－A文件[3]，采用多項式回歸方案進行線性評價試驗。分別選取Mediace TPLA低值(0.5 T.U.)和高值(237.0 T.U.)血清，按比例進行梯度稀釋。所有樣品充分混勻，隨機排列上機檢測，每個樣品重復(fù)檢測4次。T.U.是參考世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)品[THE INTERNATIONAL STANDARD for SYPHILITIC HUMAN SERUM(1stinternational standard preparation，established in 1958)]設(shè)定的，1 T.U.相當(dāng)于2 mIU。

6.靈敏度與特異度以CMIA檢測結(jié)果為相對標(biāo)準(zhǔn)，用Mediace TPLA檢測111例、78例TP－Ab陽性、陰性標(biāo)本，按說明書建議的Cut－off值(10 T.U.)計算其靈敏度與特異度。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

使用Excel 13.0計算均數(shù)(x－)、標(biāo)準(zhǔn)差(s)，并進行相關(guān)性分析。

結(jié)果

一、精密度試驗

精密度試驗結(jié)果顯示，3個濃度水平的總變異系數(shù)(CV)均＜10%，見表1。

二、干擾試驗

干擾試驗的結(jié)果均在95%～105%之間，提示試劑的抗干擾能力較強，見表2。

排除梅毒感染的30例ANA陽性患者血清、10例妊娠期婦女血清及10例肝炎患者血清均未對Mediace TPLA檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。

三、分析測量范圍

線性試驗結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)(r)為0.996;評價結(jié)果顯示Mediace TPLA在0～250 T.U.范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。見圖1。

四、靈敏度與特異度

以CMIA檢測結(jié)果為相對標(biāo)準(zhǔn)，按說明書建議的Cut－off值，其靈敏度為99%、特異度為100%。見表3。經(jīng)統(tǒng)計，CMIA定量檢測結(jié)果與Mediace TPLA定量檢測結(jié)果在各自線性檢測范圍內(nèi)無相關(guān)性，見圖2。

189例標(biāo)本中存在1例Mediace TPLA與CMIA結(jié)果不符的情況，Mediace TPLA結(jié)果為陰性，而化學(xué)發(fā)光結(jié)果為弱陽性。用RPR、TRUST及TPPA復(fù)檢該標(biāo)本，結(jié)果均為陰性。

討論

機體感染梅毒螺旋體后可產(chǎn)生非梅毒螺旋體類脂質(zhì)抗體[即反應(yīng)素(reagin)]和梅毒螺旋體特異性抗體(TP－Ab)。目前，臨床上常用TRUST、RPR等方法檢測其非特異性抗體，化學(xué)發(fā)光法、TPPA、TPHA、ELISA、FTA－ABS、膠體金等方法檢測其特異性抗體。上述試驗多為手工方法，操作繁瑣、耗時長、人為影響因素較多[4]。CMIA的靈敏度與TPPA相當(dāng)，兼具快速、高通量等優(yōu)點，但不能開放用于其它儀器[5]。Mediace TPLA是能應(yīng)用于各種開放生化檢測平臺的梅毒螺旋體抗體檢測試劑，為了分析其臨床適用性，本研究對其進行了性能評估。

本研究表明，Mediace TPLA具有良好的批內(nèi)、批間和天間精密度，分析測量范圍較寬，測定結(jié)果不受輕度溶血、脂血、生理濃度的膽紅素及類風(fēng)濕因子的影響，與現(xiàn)有的只能用于配套檢測系統(tǒng)的免疫分析試劑性能相當(dāng)。常見的易對梅毒檢測結(jié)果造成干擾的病理生理情況，如自身免疫性疾病、妊娠、肝炎等也均未對Mediace TPLA的檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。本研究結(jié)果顯示CMIA定量檢測結(jié)果與Mediace TPLA定量檢測結(jié)果之間在各自線性范圍內(nèi)無相關(guān)性，這與WATANABE等[9]的研究結(jié)束一致，推測可能是由于不同檢測方法所包被的抗原不同所引起，故在進行方法學(xué)替代階段應(yīng)及時向臨床說明。

本研究同時用Mediace TPLA及CMIA檢測189例梅毒陰陽性血清，以CMIA結(jié)果為相對標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)Mediace TPLA的靈敏度及特異度均較高。189例結(jié)果中存在1例不符的情況，該例標(biāo)本Mediace TPLA檢測結(jié)果為陰性(－1.1 T.U.，Cut－off值為＜10 T.U.)，而CMIA檢測結(jié)果為弱陽性(1.17 S/CO，Cut－off值為＜1 S/CO)。用RPR、TRUST及TPPA復(fù)檢，結(jié)果均為陰性。結(jié)合該患者的病史、癥狀、體征，可基本排除梅毒既往及現(xiàn)癥感染。在臨床工作中，CMIA出現(xiàn)假陽性的情況也會出現(xiàn)。有研究者已對化學(xué)發(fā)光法假陽性的原因進行了分析，試劑方面的可能原因包括合成的基因重組多肽抗原過長、抗原數(shù)量有限、抗原不純、以血清白蛋白作為橋聯(lián)等使非特異性反應(yīng)增高[6－8]。故在梅毒診治過程中應(yīng)結(jié)合病史、癥狀、體征及多種血清學(xué)檢測方法進行綜合判斷。同時，對CMIA結(jié)果應(yīng)制定相應(yīng)的復(fù)檢規(guī)則。

總之，采用Mediace TPLA快速檢測梅毒螺旋體性抗體，具有常規(guī)手工方法的基本性能，可排除人為操作和判斷結(jié)果的誤差。同時，因能開放應(yīng)用于自動生化分析儀，可快速檢測大量標(biāo)本，提高工作效率，在獻(xiàn)血員篩查、健康人群查體及臨床應(yīng)用中都具有一定的優(yōu)勢[10]。

[1]陳祥生.我國梅毒流行現(xiàn)狀及防治策略[J].國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志，2008，35(2):73－77.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute.Evaluation of precision performance of quantative measurement methods;approved guideline－2nd ed[S].EP5－A2， CLSI，2004.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.Evaluationof the linearity of quantitative measurement procedures:a statistical approach;approved guideline[S].EP6－A，CLSI，2003.

[4]王華成，陳茶，楊夢心，等.乳膠凝集免疫比濁法檢測梅毒特異性抗體的性能評價[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，33(15):1877－1878.

[5]袁明生.化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法檢測梅毒螺旋體抗體的應(yīng)用評價[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2010，25 (7):571－572.

[6]傅均星，周瀟，曾鐵兵.基因重組抗原ELISA法在梅毒螺旋體抗體檢測中的評價[J].南華大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2004，32(3):305－306.

[7]王柳溪.TP－ELISA法檢測老年人梅毒抗體易產(chǎn)生假陽性原因分析[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐，2008，21 (9):1085－1086.

[8]郭慧娟，尚曉泓.微粒子化學(xué)發(fā)光法檢測梅毒抗體陽性結(jié)果分析[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8 (20):2444－2445.

[9]WATANABE N，NAGATOMO R，OKUBO S，et al.Evaluationoflatexagglutinationtestforantitreponemal antibody in comparison with chemical luminescence tests[J].Rinsho Byori，2011，59(2): 115－120.

[10]HUH HJ，LEE KK，KIM ES.et al.Analysis of positive results in mediace rapid plasma reagin and treponemapallidumlatexagglutinationasthe automated syphilis test[J].Korean J Lab Med，2007，27(5):324－329.

Evaluation on the performance of a latex agglutination assay for treponemal specific antibody

HU Liang1，CHEN Yi1，CHEN Changqiang1，QU Chenyun1，GU Zhidong2，F(xiàn)AN Qishi1.(1.Department of Clinical Laboratory，Ruijin Hospital(North)，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 201801，China;2.Department of Clinical Laboratory，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200025，China)

ObjectiveTo evaluate the analytic performance of a latex agglutination assay for treponemal specific antibody(Mediace TPLA).MethodsThe EP documents established by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)were referred to evaluate the analytic performance.A total of 110 syphilitic positive and 78 syphilitic negative sera were detected by Mediace TPLA，and the results were compared with those of chemiluminescence microparticle immunoassay(CMIA).ResultsThe total coefficients of variation(CV)were 8.77%，3.94%and 6.57% respectively at the concentration levels of 8.0，28.6 and 166.0T.U..The linear range was from 0 to 250 T.U.，and the total recovery rate was 95.31%.The results were not significantly affected by hemolysis(hemoglobin＜4.8 g/L)，lipidemia(triglyceride＜8 mmol/L)，jaundice(bilirubin＜20 μmol/L)and rheumatoid factor(＜450 IU/mL).The results of 30 antinuclear antibody(ANA)positive patients，10 hepatitis patients and 10 pregnant women were all negative.When the results of CMIA were defined as the reference standard，the sensitivity of Mediace TPLA was 99%，the specificity was 100%，and the cut－off value was 10 T.U..ConclusionsMediace TPLA has excellent antiinterference ability，repeatability，high accuracy，wide linear range and specificity.It can also be used in automated biochemical analyzers.

Syphilis;Latex agglutinaion assay;Serological detection

1673－8640(2015)03－0250－04

R446.1

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.012

2014－06－18)

(本文編輯:龔曉霖)

上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計劃項目(14411964500);上海申康醫(yī)院發(fā)展中心資助項目(SHDC12010215)

胡亮，男，1987年生，學(xué)士，技師，主要從事臨床免疫學(xué)檢驗工作。

顧志冬，聯(lián)系電話:021－67888237。